抑制性减法杂交主要原理

其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。因此SSH显著增加了获得低丰度表达差异cDNA的概率，简化了对消减文库的分析。

抑制PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，使非目标序列片段两端的长反向重复序列在复性时产生“锅柄样”结构或“发夹结构”而无法于引物配对，从而选择性的抑制非目标序列的扩增。同时，根据杂交的二级动力学原理，丰度高的单链cDNA复性时产生同源杂交速度要快于丰度低的单链cDNA，从而使得丰度存在差异的cDNA相对含量趋于基本一致

抑制性减法杂交suppression subtractive hybridization，ssh　1996年，L.Diathebko在RDA的基础上建立了抑制性减法杂交技术，该技术是RDA技术的发展，能有效克服RDA或cDNA RDA技术难以解决的问题。

（1）制备两种试验材料的mRNA并反转录成cDNA，分别作为检测cDNA和驱赶cDNA。用限制性核酸内切酶切割，产生大小适当的平头末端cDNA片段

（2）将检测cDNA分成均等的两份。分别接上接头1或接头2，接头有一长链和一短链组成的一段是平末端的双链cDNA分子。长链3’端与cDNA5’端相连。长链外侧序列与第一次PCR引物序列相同，内侧序列则与第二次PCR引物序列相同。此外，接头上含有T7启动子序列及内切酶识别位点。为以后将该片段插入克隆载体和测序提供便利。

（3）第一次差减杂交。

（4）第二次差减杂交

（5）第一次PCR反应

（6）第二次PCR反应

（7）差异片段的初步筛选

优点

特异性强，假阳性率低

高敏感性

速度快，效率高

缺点

SSH技术对其实材料要求多

SSH技术得到的cDNA是限制酶消化的cDNA，不再是全长cDNA

所研究材料的差异不能太大

抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH) 是建立在抑制PCR 与消运用杂交二级动力学原理，减杂交技术相结合的基础上的更简单快速的分离差异基因的方法。即丰度高的单链DNA 在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，使原来在丰度上有差别的单链DNA 相对含量达到基本一致，利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。

中文名称

抑制消减杂交

英文名称

suppression subtractive hybridization;SSH

定　　义

将抑制PCR与消减杂交技术相结合的一种快速分离差异表达基因的方法。

应用学科

遗传学（一级学科），基因组学（二级学科）

SSH 即抑制消减杂交技术是由Diatchenko 等于1996 年以m RNA 差别显示技术为基础建立起来的筛选未知差异表达基因的新技术。它主要基于最近出现的抑制PCR , 并结合标准化(normalization 或equalization ) 和消减杂交( substractive hybridization)。抑制PCR 通过利用含引物序列的双链接头(adaptor) 充当引物模板, 使两端接上同一接头的非目的双链片段具有反向末端重复序列, PCR 中不能扩增, 从而达到抑制非目的片段而选择性扩增目的片段的目的。标准化步骤平衡了目的基因群中cDNA 的丰度, 即低丰度差异表达的基因不会丢失, 而高丰度差异表达的基因又不会被过量分离。消减杂交则扣除了目的基因群( tester) 与驱赶基因群(driver) 间的同源序列。

存在于tester 中而不存在于driver 中, 或在tester 中较在driver 中有高水平表达。

①第一次差减杂交,用过量的drivercDNA分别与tester2adaptor1cDNA和tester2adaptor2cD2NA杂交。分别形成SSH技术原理图所示的tester单链片段a、tester双链片段b、tester2driver同源双链片段c和driver单、双链片段d。根据杂交二级动力学,丰度较高的分子产生同源杂交体(homo2hy2brid)的速度较快,使高丰度与低丰度单链片段a浓度大致相等,从而实现tester单链片段a的标准化[6],并使连接一种接头的差异表达基因a初步富集。②第二次差减杂交,将上述分别与drivercDNA杂交后的tester2adaptor1和tester2adaptor2cDNA混合,再加入新制备的变性drivercDNA,因tester2adaptor1和tester2adaptor2cDNA同源,除形成a、b、c、d片段外,又形成了新的连接有两种接头的双链杂交片段e,即连接两种接头的差异表达序列e,是进行PCR指数扩增的模板。

PCR之前填补分子粘性末端以利于退火。第一轮PCR,加入针对adaptor1和adaptor2外侧序列的特异引物进行扩增。结果:a、d片段因没有引物结合位点,不能进行PCR扩增;b片段由于两端均为同一接头,具有反向末端重复序列(invertedre2peats),在单链内部形成互补发卡结构的可能性及稳定性均大于引物与其配对结合的可能性及稳定性,故在PCR反应中不能扩增;c片段的一端为一种接头而另一端无接头,只能线形扩增;只有e片段末端有两种不同接头,可通过PCR作指数扩增。第二次PCR,加入一对与接头内侧序列相同的巢式PCR特异引物,进一步富集差异表达序列并降低背景。经过两轮PCR,基于PCR抑制效应的存在,以及选用了两对引物,可以特异扩增代表了差异表达的cDNA片段。

经上述PCR所得的差别表达基因片段可以利用接头上存在的酶切位点,插入适当载体,转化细菌。经X-Gal蓝白菌落初步筛选,获得具有差异表达cDNA片段的阳性克隆。然后通过Northern杂交鉴定,cDNA序列分析,可获得一些新的ESTs序列,如进一步对该ESTs进行深入的结构和功能研究,可望获得新的具有重要生物学作用的全长功能基因。

内容简介

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