原生质体培养

主要来源:植物的叶片，根尖，花粉，愈伤组织细胞等。

原生质体的纯化方法:沉降法、漂浮法、界面法。

机械分离法:常用于分离藻类原生质体，采用渗透方法使细胞发生质壁分离，用刀把细胞壁切破，使原生质体流出。(手工操作难度大，得率低，费时费力)

酶解分离法:用酶(琼脂酶，果胶酶，纤维素酶等)将细胞壁分解。(条件温和，原生质体完整性好，活力高，得率高) 因此原生质体制备多采用酶解法，此法操作过程分为:取材消毒，酶解制备， 原生质体收集。

是指用特殊方法脱去了植物细胞壁的、裸露的、 有生活力的原生质团。没有细胞壁，但具有活细胞的一切特征。

①无细胞壁障碍，可以方便地进行有关遗传操作，并可以对膜，细胞器等进行基础研究。

②具有全能性，并能进行人工培养发育成完整植株。

③原生质体适合进行诱导融合形成杂种细胞。

即检验所获得的原生质体是否是真正的原生质体

(1)低渗胀破法:把原生质体放入低渗透溶液中，在显微镜下观察原生质体从低渗溶液中吸水胀破的过程。如果是真正的原生质体，因为没有细胞壁，这样在胀破后留下的残迹应该是无形的。如果原生质体还带有部分细胞壁，则原生质体从无壁部分吸水向外膨胀直至胀破，破碎后留下的残迹仍保持半圆形的细胞壁。

(2)荧光染色法:将原生质体放入离心管中，加入0.7mol/L甘露醇配置的 0.05%~0.1%荧光增白剂溶液，染色5~10min，离心、洗涤除去多余的染料，在荧光显微镜下观察。绿色光显示纤维素的存在，发出红色光的是没有纤维素的真正的原生质体

检验原生质体是活细胞还是死细胞

染色法:

①二乙酸荧光素(FDA)法:FDA本来没有荧光，当其进入细胞后被脂酶分解为具有荧光的极性物，不能透过质膜，而是留在细胞内发出荧光。因此能发出荧光的是具有活性的原生质体。

②酚藏花红染料法:具有活力的原生质体吸收染料显红色;无活力的不能吸收染料而显示白色。

③伊文思蓝染色法:有活力的细胞不能吸收染料为无色;而没活力的细胞则能吸收染料显蓝色。

其他法:①胞质环流法②渗透压变化③氧电极法④形态观察法

经原生质体培养的植株再生一般经过细胞壁再生，细胞分裂成细胞团、愈伤组织(或胚状体)、植株再生这几个过程。

①细胞壁再生:原生质体在合适条件下短时间内开始膨胀，叶绿体重排，并开始合成新的细胞壁，进而由球形变成椭圆形。

②细胞分裂:不同的植物细胞分裂时间不同。为了细胞能持续分裂，应注意及时添加新鲜培养液。

③愈伤组织:细胞不断分裂形成细胞团，并进一步形成愈伤组织。一些植物由细胞系形成胚状体。愈伤组织诱导:在合适的培养基，通过调节生长素和细胞分裂素的比例。

④植株再生，诱发芽和根的生成。 诱导胚状体:在原生质体培养时直接诱发胚状体的生长，从而发育成完整植株。

主要有液体浅层培养法、液体悬滴培养、固体平板法、固液双层培养法(应用最广泛)、琼脂糖珠培养法

①植物原生质体是细胞无性系变异和突变体筛选的重要来源;

②植物原生质体是细胞融合工作的基础;

③植物原生质体是植物遗传工程的理想受体和遗传饰变的理想材料;

④在细胞生物学与遗传理论研究上的应用。