显微技术

共聚焦显微技术是在荧光显 微分析技术的基础上发展起来的，利用荧光显微镜可以对生物样品发出的荧光进行观察和分析，但是荧光显微镜收集到的是样品的整体荧光，来自样品内不同部位的 荧光信号相互干扰。难以区分，无法获得准确的定位和定量信息。 共聚焦显微技术的出现很好地解决了这一问题，这一技术可以获取细胞内某个薄层面上的荧光信息，而该层以外的信号被消除掉，成像清晰程度大大提高；结合计算 机自动控制，可以对荧光信号的分布、强度和动态变化进行全方位的分析，得到丰富的信息。

与传统显微镜相比共聚焦显微镜可抑制图像的模糊，获得清晰的图像；具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片；增加侧向分辨率；由于点对点扫描去除了杂散光的影响。

共聚焦显微技术的应用范围包括形态学观察与测量、生物学测量蛋白质功能检测与包括在光谱测量中的其它方面的应用。

其中该技术在形态学的观察与测量方面包括亚细胞器定位，如最简单的二维定位、定量及三维定位、图像重组等。

生物学测量方面可以分为动态与静态的生物学测量，在动态与静态水平都可以同时检测活细胞或组织内游离Ca2+分布和浓度的变化(Mg2+ 、Na+ 、K+等)、自由基的动静态水平、线粒体膜电位的动静态变化及蛋白质的转位（不过静态测量时需用固定样品）。此外，动态测量还可以对药物进入细胞的动态过程进行定位分布及定量。

蛋白质功能检测[6]可分为蛋白荧光恢复的测量(FRAP)与FLIP、笼索解笼索的测量与动态/静态兼可的荧光能量共振转移(FRET)三种测量方式。

共聚焦显微镜利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点

共聚焦原理

探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在 样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔内，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭 的，因此被探测点即为共焦点，被探测点所在的平面即为共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫 描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器 上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面的连续光切图像。