双光子生物荧光标记材料的基础研究

双光子生物荧光标记材料是实现分子生物学、生物医学活细胞成像的重要物质基础。本项目就双光子生物荧光标记材料的原理、分子结构-双光子性质关系、识别机制和发光性质展开了系统的理论研究。主要侧重于两大问题的研究：分子电子结构－双光子性质的关系，性质优良的双光子生物荧光探针材料的分子设计。取得了一些重要研究成果如下： I, 拓展了研究双光子吸收截面的方法。我们在充分利用完全态求和公式SOS的基础上，结合半经验ZINDO方法，明确考虑单激发和双激发的作用，对中大尺度的分子体系的双光子吸收性质的关系进行研究；同时考虑到半经验方法在定量评估双光子吸收上的不足，我们也用微扰理论推导出的双光子响应理论进行了系统研究，利用它结合含时密度泛函理论实现了对中小尺度分子的双光子吸收性质的理论预测，在大小一致性方面取得了相对准确的评估。 II, 总结了双光子荧光探针的工作机理。荧光探针识别机理一般可分为开关型和比率型两大类。开关型（OFF-ON）探针是基于荧光强度的改变来识别，主要源于光诱导电子转移机理(PET)，而比率型探针依据荧光光谱变化（红移或蓝移）进行识别，主要包括光诱导电荷转移（PCT)或分子内电荷转移(ICT)，荧光共振能量转移(FRET), 跨键能量转移(TBET)，激发态分子内质子转移型 (ESIPT)，以及激发单体-激基缔合物机理等。而双光子荧光探针的主要机制是PET、PCT、FRET和TBET。 III，理论研究和提出了一些重要双光子荧光探针分子。针对探测Zn2 , Cu2 , Mg2 , PH,NO,DNA等分子离子，设计出一些新型的双光子荧光探针分子的候选物。这些新设计的探针分子的双光子吸收波长均位于近红外光区，而且双光子吸收截面值都大于100GM，有效地避免了生物自荧光和激发光光强对材料的光损伤。 IV,详尽地研究了潜在荧光标记染料氮桥四萘嵌苯衍生物、六苯并晕苯衍生物、吡咯有机染料、系列大环噻吩衍生物、石墨烯杂化材料等的分子结构与双光子吸收性质等光物理性质之间的关系，提出了调控与设计具有强双光子吸收和高荧光量子产率的分子设计策略。在寻找新型双光子染料、增强其响应方面的研究发现，溶剂效应、氮桥数目和共轭强度、卟啉杂化、取代基的数量和位置、强度、尺度等都对双光子的吸收性质产生重大影响，分析了增强双光子吸收的结构因素，获得了调控双光子响应的策略等重要信息。

双光子吸收是一种三阶非线性光学效应，双光子荧光显微技术是双光子吸收材料最有可能获得实际广泛应用的方向之一。双光子生物荧光标记材料是实现成像的关键。本项目旨在深入探讨双光子吸收与荧光发射原理，研究典型双光子荧光探针分子结构，电子结构特征与双光子吸收、荧光发射的关系，摸索其用于生物活体检测显微成像的双光子生物荧光标记材料的设计规律，完善双光子荧光探针设计的原理，并将其付诸实际应用，争取针对实际问题进行新型的双光子荧光成像材料的分子设计，拓展和促进双光子标记材料在生命过程分析方面的应用。

生物传感器按是否使用标记物分为两类：一类是标记型生物传感器，检测时先用荧光素、放射性同位素或酶等标记物对被测生物进行标记，然后通过检测标记物的信号来获取被探测物的信息。目前使用的免疫传感器大多数属于这一类，然而利用放射性标记物检测，对于工作人员具有一定的危害，用荧光检测时非特异性荧光也会影响测量结果。标记型生物传感器所用的测试仪器体积大、价格昂贵、耗时，需要专业人员完成，并且指示剂价格昂贵，要集合几十个样本同时测量，让患者在等待中承受巨大的痛苦。另一类是免标记型生物传感器，不需要对探测物进行标记，而是直接通过生物复合物形成时的物理、化学变化对生物对象进行检测，极大地简化了操作过程，因此免标记生物传感器成为了生物传感器的一个重要研究方向 。

免标记生物传感器按照工作原理不同分为：表面等离子体谐振腔生物传感器、光学谐振腔生物传感器、光子晶体生物传感器和光纤生物传感器等。免标记光纤生物传感器是免标记生物传感器家族中的重要一员，是光纤技术与生物技术结合的产物。由于光纤传感器具有灵敏度高、结构简单、不易受电磁干扰等其它器件所不具备的优点，而免标记的生物检测方法又可以将生物化学反应直接转变为可测信号，不需要加入标记物，测试过程简单直接，因此免标记光纤传感器已经成为生物传感器研究的重要方向 。

免标记光纤生物传感器的功能是将光纤上的生物敏感膜和被测物质直接接触时发生的特异性吸附反应转换成光信号，检测生物分子的特性。光纤生物传感器由两部分构成：传感段和传输段。在传感段， 首先要对光纤传感头表面进行特殊化学处理，如利用偶联法、自组装或偶联法结合卵白素-生物素桥连法等方式将生物靶分子固定于传感头表面。在发生生物化学反应时，目标分子会吸附于光纤传感头表面的生物膜层上， 使生物膜层厚度增加，改变传感头表面的等效折射率，从而影响传输光信号的特性，如：谐振波长、光功率等。通过检测传感器输出光信号的变化就可以对被测生物分子的物理化学特性进行监测； 另一部分是传输段，主要负责光信号的传输，一般会保留该段光纤的包层 。