酶标仪原理

酶标仪实际上就是一台变相光电比色计或分光光度计，其基本工作原理与主要结构和光电比色计基本相同. 图示是一种单通道自动进样的酶标仪工作原理图.光源灯发出的光波经过滤光片或单色器变成一束单色光，进入塑料微孔极中的待测标本.该单色光一部分被标本吸收，另一部分则透过标本照射到光电检测器上，光电检测器将这一待测标本不同而强弱不同的光信号转换成相应的电信号.电信号经前置放大，对数放大，模数转换等信号处理后送入微处理器进行数据处理和计算，最后由显示器和打印机显示结果. 微处理机还通过控制电路控制机械驱动机构X方向和Y方向的运动来移动微孔板，从而实现自动进样检测过程.而另一些酶标仪则是采用手工移动微孔板进行检测，因此省去了X,Y方向的机械驱动机构和控制电路，从而使仪器更小巧，结构也更简单.

微孔板是一种经事先包埋专用于放置待测样本的透明塑料板，板上有多排大小均匀一致的小孔，孔内都包埋着相应的抗原或抗体，微孔板上每个小孔可盛放零点几毫升的溶液.

光是电磁波，波长100nm~400nm称为紫外光，400nm~780nm之间的光可被人眼观察到，大于780nm称为红外光。人们之所以能够看到色彩，是因为光照射到物体上被物体反射回来。绿色植物之所以是绿色，是因为植物吸收的大部分为红橙光和蓝紫光，但对绿色不吸收，反射出来，所以植物呈现为绿色。酶标仪测定的原理是在特定波长下，检测被测物的吸光值。

随着检测方式的发展，拥有多种检测模式的单体台式酶标仪叫做多功能酶标仪，可检测吸光度(Abs)、荧光强度(FI)、时间分辨荧光(TRF)、荧光偏振(FP)、和化学发光(Lum)。

酶标仪从原理上可以分为光栅型酶标仪和滤光片型酶标仪。光栅型酶标仪可以截取光源波长范围内的任意波长，而滤光片型酶标仪则根据选配的滤光片，只能截取特定波长进行检测。

检测单位

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓度与被吸收的能量成定量关系。

检测单位用OD值表示， OD是optical density(光密度)的缩写，表示被检测物吸收掉的光密度， OD=log(1/trans)，其中trans为检测物的透光值。根据Bouger-amberT-beer法则，OD值与光强度成下述关系:

E=OD=log(lo/Ι) 其中E表示被吸收的光密度， Ιo 为在检测物之前的光强度，Ι为从被检测物出来的光强度。

OD值由下述公式计算:

c为检测物的浓度 b为检测物的厚度 a为摩尔因子

在特定波长下测定每一种物质都有其特定的波长，在此波长下，此物质能够吸收最多的光能量。如果选择其它的波长段，就会造成检测结果的不准确。因此，在测定检测物时，我们选择特定的波长进行检测，称为测量波长。

但是每一种物质对光能量还存在一定的非特异性吸收，为了消除这种非特异性吸收，我们再选取一个参照波长，以消除这个不准确性。在参照波长下，检测物光的吸收最小。检测波长和参照波长的吸光值之差可以消除非特异性吸收。

检测值计算

仪器中的检测器接收透过被检测物的光能量，转换成二进位数字信号，最大为4095。仪器定义没有光源下的透光值为 0%，没有检测物的透光值为100%。则实际检测中，检测物的透光值均在 0%一100%之间。透光值

的计算如下:

T=(Meas-Min)/(Max-Min)

其中T为透光值， Meas为检测的二进位数值， Min为在 0%的情况下检测的二进位数值， Max为在100%的情况下检测的二进位数值，举例如下:

MaX=3600

Min=20

Meas=30

T=(30-20)/3600-20)=0.0028

OD=log(1/T)=log(1/0.0028)=2.552

中心定位

仪器会自动对酶标孔进行中心定位，中心定位是要消除酶标孔底的凸凹引起的厚薄不均带来检测的不准确。在对每一个酶标仪进行检测时，仪器其实要进行35个点的测量，选取最中间的5个点的均值为本孔的OD值。

光源的参照通道

参照通道是用来校准由于电压不稳或灯泡磨损带来的影响。

用途和其它提示

用于ELISA试剂的测定，广泛用于各种实验室，包括临床实验室。

质量控制

质量控制是试剂检测的重要因素。请按照试剂说明书的要求进行质量控制。

空白校正

有一些试剂盒的说明书将空白孔设置为空气，其它大多数空白孔的设置是用试剂来设置的，请按照试剂盒的说明书要求进行。

检测结果的解释

由于有相当多的因素会影响检测的结果，如不同的酶标板，检测试剂的体积，都会造成OD值的不同，因此，只有使用同一酶标板反应的试剂检测结果才能比较和分析。对结果的临床解释请依照试剂盒的说明书进行.

规格有24孔板，48孔板，96孔板等多种，不同的仪器选用不同规格的孔板，对其可进行一孔一孔地检测或一排一排地检测.

酶标仪所用的单色光既可通过相干滤光片来获得，也可用分光光度计相同的单色器来得到.在使用滤光片作滤波装置时与普通比色计一样，滤光片即可放在微孔板的前面，也可放在微孔板的后面，聚光镜，光栏后到达反射镜，经反射镜作90°反射后垂直通过比色溶液,然后再经滤光片送到光电管.

从酶标仪工作框图和光路图上可看出，它和普通的光电比色计有以下几点差异:

(l)盛装待测比色液的容器不再使用比色皿，而是使用塑料微孔板.微孔板常用透明的聚乙烯材料制成，对抗原抗体有较强的吸附作用，故用它作为固相载体.

⑵由于盛样本的塑料微孔板是多排多孔的，光线只能垂直穿过，因此酶标仪的光束都是垂直通过待测溶液和微孔板的，光束既可是从上到下，也可以是从下到上穿过比色液.

⑶酶标仪通常不仅用A，有时也使用光密度OD来表示吸光度.酶标仪可分为单通道和多通道2种类型，单通道又有自动和手动2种之分.自动型的仪器有X,Y方向的机械驱动机构，可将微孔板L的小孔一个个依次送入光束下面测试，手动型则靠手工移动微孔板来进行测量.

在单通道酶标仪的基础上又发展了多通道酶标仪，此类酶标仪一般都是自动化型的.它没有多个光束和多个光电检测器，如 12个通道的仪器设有 12条光束或 12个光源，12个检测器和12个放大器，在X方向的机械驱动装置的作用下，样品12个为一排被检测.多通道酶标仪的检测速度快，但其结构较复杂价格也较高.

可广泛应用于低紫外区的DNA、RNA定量及纯度分析(A260/A280)和蛋白定量(A280/BCA/Braford/Lowry)，酶活、酶动力学检测，酶联免疫测定(ELISAs)，细胞增殖与毒性分析，细胞凋亡检测(MTT)，报告基因检测及G蛋白偶联受体分析(GPCR)等

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多功能酶标仪指拥有多种检测模式的单体台式酶标仪。通常某些多用途高端型酶标仪支持标准1cm立式比色皿插槽，不仅仅微孔板可进行吸光度(Abs)、荧光强度(FI)、时间分辨荧光(TRF)、荧光偏振(FP)、和化学发光(Lum)检测，甚至1cm立式比色皿也可进行除吸光度检测外的荧光强度和化学发光检测。

酶标仪(MicroplateReader)是对酶联免疫检测(EIA)实验结果进行读取和分析的专业仪器。酶联免疫反应通过偶联在抗原或抗体上的酶催化显色底物进行的，反应结果以颜色显示，通过显色的深浅即吸光度值的大小就可以判断标本中待测抗体或抗原的浓度。

酶标仪广泛地应用在临床检验、生物学研究、农业科学、食品和环境科学中，特别在近几年中，由于大量的酶联免疫检测试剂盒的应用，使得酶标仪在生殖保健领域中应用越来越广泛，同时促进了生殖健康技术水平提高。

目前国内许多计生站系统开展了酶免检测项目，如:乙肝五项、艾滋病检测、优生优育系列检测、激素检测等。过去多数采用目测方法，报出的结果缺乏科学的依据。例如:某弓形虫检测试剂盒中，临界值规定为:阴性对照品的OD值×2.5，通过目测无法判断标本孔的反应颜色是否超过临界值。肉眼进行两孔之间的颜色比较可能还行，但比较一孔的颜色是否超过另一孔颜色的2.5倍就不可能。

国内多家权威机构，如卫生部临床检验中心和计划生育系统等多次强调酶标仪的重要性，并要求酶联免疫检测试剂应使用酶标仪判读，酶免试剂的质控也应使用酶标仪，并提供酶标仪测定的原始数据，而各厂家的试剂盒说明书没有是让用目测的。同时酶免检测的项目往往是一些实质性的感染和病变(如:肝炎、艾滋病、优生优育等)，判读更要求严谨，由误诊引起的纠纷很难处理。另外，住院手术病人术前的丙肝、艾滋等EIA试剂检测是避免因输血引起感染引发的医疗事故纠纷的必要手段，正逐渐被许多单位所采用。