酶标抗体制备技术

用抗HRP McAb制备PAP复合物的工艺条件较为简便，而且不需严格的条件限制。用小鼠抗HRP McAb制备的腹水，按一定的HRP/IgG克分子比混和，置37℃水浴反应2h，即成鼠PAP复合物。以按HRP/IgG克分子比为4︰1制备为宜。

碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)，系小牛肠粘膜和大肠杆菌中提炼出来的一种磷酸酯的水解酶，由多个同功酶组成。从小牛肠粘膜提取的AP分子量为100kDa，酶作用的最适pH为9.6;从大肠杆菌中提取酶分子量为80kDa，最适pH为8.0。它的作用底物较多，常用的酶底物有对硝基本磷酸盐(PNP)、β-甘油磷酸钠、磷酸萘酯等。AP主要用作双标记染色，研究递质共存及酶免疫测定。AP标记抗体，一般采用戊二醛作交联剂一步法，使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。

(1)取抗体(2~5mg/mL)1mL，加入AP 5mg溶解。

(2)装入透析袋，用0.01mol/L、Ph7.2PBS4℃透析18h，换液3次。

(3)加入2.5%戊二醛20uL，室温(20℃±)放置2h。4℃0.01mol/L、pH7.2PBS透析过夜，换液3次。

(4)移入0.05mol/L、pH8.0Tris-HCl缓冲液中，4℃透析过夜，换液3次。

(5)取出标记抗体，用含%BSA和0.02%NaN3的Tris-HCl缓冲液稀释至4mL，即为酶标记物原液。

(6)加入1/3量纯甘油，测定工作效价后，小量(0.1mL)分装，4℃保存(使用前以pH7.4PBS-吐温溶液将结合物适当稀释)。

辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)广泛分布于植物中，因辣根中含量最高而得名，由无色酶蛋白和深棕色铁卟啉(辅基)构成一种糖蛋白(含糖18%)。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。

HRP分子量较小(40kDa)，标记物容易穿透入细胞内部;作用底物为H2O2，以二氨基联苯胺(DAB)为供氢体的反应产物为不溶性的棕色吩嗪衍生物，可用普通光镜观察;在pH3.5~12范围内稳定，对热及有机溶剂的作用亦较稳定，能耐受63℃加热15min;用甲苯与石腊包埋切片处理或用纯乙醇及10%甲醛水溶液固定作冰切片均不影响其活性;溶解性好，100mL缓冲盐溶液中可溶解5gHRP，并可溶解于62%饱和度以下的硫酸铵溶液中，故常用硫酸铵分级沉淀法分离纯化;氰化物、硫化物、氟化物、及叠氮化物等对HRP的活性有抑制作用，应避免使用NaN3作为酶标试剂的防腐剂，以防止失活。

凡能在HRP和H2O2存在时被酶催化H2O2反应而和成有色产物的化合物(供氢体)都可以用显色剂。供氢体的产物分不溶性和可溶性两类。前者最常用的为3，3'二氨基联苯胺(3,3'diaminobenzidine,DAB)，适用于免疫组化法;反应后的氧化型中间体迅速聚合，形成不溶性棕色吩嗪衍生物;这种多聚物还能还原和螯合四氧化饿，形成具有电子密度的产物，适用电镜检查;此外还有饱和联苯胺溶液，氧化后产物呈黄褐色，多用于酶免疫扩散的深沉线显色。后者最常用的为邻苯二胺(O-phenylene diamine,OPD)，产物橙色，可溶性、敏感性高，最大吸收值为490nm，可用肉眼判别;易被浓酸终止反应，颜色可数小时不变，是ELISA中最常用的一种;但对光敏感，使用时要避光，并发现有致癌作用。

用HRP标记抗体需借助交联剂的作用，将酶连接在抗体分子上。常用的交联剂为过碘酸钠和戊二醛(glutaraldehyde,CHO-(CH2)3-CHO)。

HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠氧化为醛基，再与抗体蛋白的氨基形成schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身偶联，在标记前先用2，4-二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后，再加入硼氢化钠(NaHB4)还原成稳定的结合物。

[标记步骤]

(1)取5mg HRP溶于0.5mL蒸馏水，加入1%2，4而二硝基氟苯(DNFB)无水乙醇溶液0.1mL，室温(20℃±)下轻微搅拌作用1h。

(2)加入1mL 0.06mol/L NaIO4，室温下避光轻搅30min，溶液呈黄绿色。

(3)加入1mL0.16mol/L乙二醇，室温(20℃±)下轻搅作用1 h，终止氧化反应。

(4)加入5mg抗体(Ig)，装入透析袋，置0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液(无水碳酸钠1.5g，碳酸氢钠2.93g,蒸馏水加至1 000 mL)1 000 mL中，4℃透析过夜，更换3次。

(5)取出透析袋中液体(约3 mL)，加入5mg/mLNaHB4 0.2 mL 4℃ 2h或过夜。

(6)加50%饱和硫酸铵(NH4)2SO4溶液(硫酸铵850g，蒸馏水加至1 000 mL，以30%氨水调pH7.2)6 mL沉淀结合物，置4℃30min后，3 000r/min离心30min，取深沉(SPA不需要进行此步)。

(7)将沉淀物溶于PBS(0.02M pH7.4)中，装入透析袋，并以此缓冲液透析平衡6-12h，换液3次。

(8)在结合物内加入BSA至蛋白浓度为10mg/ mL，或加等量60%甘油，测定工作效价后，小量分装(或冻干，不需加甘油)，低温保存备用。

戊二醛是一种常用的同型双功能交联剂，通过它的两个醛基分别与HRP和抗体蛋白的氨基结合，形成HRP-戊二醛-Ab蛋白结合物。反应可在4-40℃温度范围，pH6.0~8.0 的缓冲溶液中进行，分为一步法和二步法，戊二醛一步法是将酶和待标记抗体混合，同时加入戊二醛进行交联反应。戊二醛二步法是将酶先与戊二醛作用，形成酶-戊二醛结合物，结过透析或层析除去未结合的戊二醛，然后再与抗体结合。

[标记步骤]

(1)取10mgHRP溶于0.2 mL1.25%戊二醛(用0.01mol/L、pH6.8PB将25%戊二醛稀释为1.25%)，室温(20℃左右)反应结合18h。

(2)用0.15mol/LNaCl平衡过的Sephadex G-50凝胶柱洗脱，除去游离的戊二醛，或用0.01mol/L，pH7.2PBS，4℃透析过夜。

(3)将5mg抗体IgG溶于1mL0.15mol/L NaCl，再与醛化HRP溶液(10mg/mL)混合。

(4)加入0.1mL 1mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液(调节pH至9.0~9.6)，4℃，电磁搅拌下结合24h。

(5)加入0.1mL0.2mol/L赖氨酸(0.29g溶于10mL蒸馏水)，4℃放置2h，以封闭残留的醛基，终止反应。

(6)装入透析袋，以0.01mol/L、pH7.2 PBS，4℃透析过夜，或通过Sephadex G-200凝胶柱层析，用PBS洗脱，收集第1峰洗脱液，加入等量60%甘油，测工作效价后，小量分装，4℃或-20℃保存。

抗过氧化物复合物制备技术

Stemberger(1970)等，首先报道了过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物(peroxidase-antiperoxidase,PAP)法，此法也称为非标记抗体酶法(unlabelled antibody enzymemethod)。PAP法不需用任何化学交联剂处理酶和抗体，二者活性不受化学反应的影响，可大大提高免疫酶法的灵敏度。

(1)取5mL抗HRP血清，16 000r/min 4℃离心20min，取上清液。

(2)加入1mL HRP(2mg/mL)溶液混匀，室温(20℃±)静置1h，16 000r/min，4℃离心20min，取沉淀物。

(3)加冷生理盐水反复洗涤-离心(16 000r/min，4℃离心20min)3次，弃上清，取沉淀物。

(4)加入过量HRP溶液4mL(2mg/mL)混匀后，移至小烧杯内。

(5)在pH计监控下，边搅拌边加入0.1及0.01mol/L HCl调至pH2.4左右，使沉淀完全溶解。

(6)立即加入0.01mol/LnaOH,调pH7.4，16 000r/min，4℃离心20min，取上清液。

(7)加入1/10体积的0.075mol/L醋酸钠和0.15mol/L醋酸铵的等量混合液后混匀。

(8)电磁搅拌下逐滴加入等量饱和硫酸铵溶液，并继续搅拌10min，4℃放置20min，16 000r/min，4℃离心20min，去上清，取深沉物。

(9)以50%饱和硫酸铵洗涤，4℃、16 000r/min×20min，离心2次，取深沉物。

(10)加5mL蒸馏水将深沉物溶解后装入透析袋，用Ph6.75醋酸盐缓冲液(13.5L生理盐水、1.5L蒸馏水、75mL 1.5mol/L醋酸钠及75mL粉酶3moL/L醋酸铵)4℃透析3d，每天换液2次。

(11)17 000r/min，4℃离心20min，取上清液进行工作效价鉴定。

(12)加等量60%甘油，小量分装，-20℃保存。

-抗碱性磷酸酶复合物制备技术

Mason等(1978)，用碱性磷酸酶代替过氧化物酶，建立了碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶复合物(APAAP)桥联酶标技术。但以AP作为抗原用常规免疫方法制备的抗血清，很难达到APAPP桥联酶标技术的质量要求，在一定程度上限制了此项技术的推广使用。杨志刚等(1989)利用抗AP的McAb建立了一种制备APAAP复合物的简便方法。只需将AP和抗AP的McAb以适当比例混合，4℃结合过夜即可使用。采用改良的ELISA方法检测APAAP复合中AP的最适含量。具体方法是:用羊抗鼠Ig包被微量滴定板;加入一定量的抗APMcAb;分别加入不同量的AP作用后经过洗涤;加底物显色，测定光密度值(OD)。在一定范围内，APAAP复合物溶液中AP含量增加的同时，相应的OD值也随之增大;当AP增加到一定量时(约6~8mg/mL)、OD值保持稳定。

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还有一种需要纯化抗体的试验，是从多克隆抗血清中分离抗原特异性抗体。多克隆血清中含有复杂多样的抗体，它不仅含有针对免疫原产生的抗体，还有血清的全部抗体。出于特定目的的需要，必须将抗原的特异性抗体分离出来。例如使用抗肽抗体时，需要分离出特异性识别肽段的抗体。通过纯化能获得特异性很高的抗体。纯化抗体的另一用途是降低本底。几乎在所有技术中，使用纯化抗体都能降低非特异性本底。产生这种效果主要是因为一方面能去除引起实验误差的污染蛋白，另一方面能精确控制实验中产生阳性信号的抗体量。使用纯化抗体不会使本底增加，因此纯化抗体可以作为所有免疫化学实验中降低本底的基本手段。

抗体的纯化通常是浓缩抗体的最简单方法。任何来源的抗体可以用蛋白A或蛋白G的纯化方法来浓缩。

尽管纯化抗体的方法较多，建议用蛋白A或蛋白G微球纯化法作为最常用的方法。这种方法效率高，能为常用的实验方法提供足够纯化的抗体，而且随着商品化的蛋白A和蛋白G基质的出现，能将任何来源的抗体纯化。抗体的纯化也可采用传统的色谱法，在某些情况下非常有用。这些方法包括DEAE离子交换色谱法、硫酸铵沉淀法及其他方法。但是用蛋白G或蛋白A亲和柱法纯化较其他方法简单，并且纯化效果是其他方法的数倍。