离子交换色谱操作模式

1、填充床色谱

填充床色谱是最常用的方法。将离子交换剂填充在一个柱子中，颗粒之间只有很小的间隙体积。为了使填充床模式有效工作，样品必须没有颗粒，因为样占占中的颗粒物质会阻塞介质颗粒间的小通道，所以样品必须在上离子交换柱前进行澄清处理．这样可避免堵塞柱子、降低流速。用大颗粒的介质在某种程度上可以减少这种问题。

2、扩张床色谱

扩张床色谱是利用吸附剂的粒径和密度分布，其顶部装有高度调节器．流动相从床底流体分布器输入，床内吸附剂产生膨胀，相互间的空隙增大，床层压降低，可以允许料液中细胞、细胞碎片等固体颗粒通过。扩张床是一种单步操作过程。在这个过程中，目的产物可以不通过分离澄清、浓缩和初步分离而直接从含微颗粒的粗品原理中纯化。

3、顶替色谱

在顶替色谱中，使用了终端置换剂。即结合在柱上的各种蛋白质被一种亲和能力比样品中任何蛋白质都要强的分子洗脱。这样，最后被替代的分子推动着前面所有样品的成分。从某种意义上说，被替代的蛋白质也相互替代．按照亲和性递增顺序重排。

离子交换色谱的流动相通常是含盐的缓冲水溶液。为了适应不同的分离需要，有时添加适量的能与水相溶的有机溶剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等，以改进样品的溶解性能，提高选择性，改善分离。

在以水溶液为流动相的离子色谱中，缓冲溶液的浓度直接影响着离子平衡。当缓冲液浓度增加时，流动相中反离子浓度的增加，增强了它与样品离子争夺离子交换官能团的能力，从而减弱样品组分与离子交换树脂的亲和性。流动相中的离子类型对样品分子的保留值产生显著的影响。流动相中不同的离子与离子交换树脂相互作用的能力不同。

在离子交换色谱中，还可以通过改变流动相的pH值来控制样品分子的保留值。pH值能影响样品分子的解离程度，从而影响它们与离子交换剂相互作用的强弱。在阳离子交换色谱中增加pH值，溶质分子的解离减少，降低了它们与离子交换剂上阳离子的竞争能力，从而降低了保留值 。

离子交换色谱的固定相有阳离子交换剂和阴离子交换剂两种。阳离子交换剂带有负电荷，用于阳离子的分离；阴离子交换剂带有正电荷，用于阴离子分离。阳离子交换剂最常用的官能团有磺酸盐型，阴离子交换剂最常用的官能团是季胺型。

除强离子交换剂外，还有弱离子交换剂，它们的交换官能团具有弱酸性或弱碱性。羧酸(一C00H)交换剂是一种弱阳离子交换剂，只能在pH足够高到使羧酸解离时才能起交换作用。叔胺(一NR₃)基交换剂是弱阴离子交换剂，只有在酸性介质中才有交换作用。

常用离子交换剂的性能见图1。

(1)按离子交换剂的基质可分为3种。

1)有机共聚物树脂。有机共聚物树脂中应用最广泛的是聚苯乙烯(PS—DVB)型树脂。按照树脂的物理结构又分为微孔型离子交换树脂、大孔型离子交换树脂、薄壳型离子交换树脂和表面多孔覆盖型离子交换树脂。

2)硅胶微球离子交换剂，也就是键合相离子交换剂。它是以硅胶作载体的离子交换剂．主要有全多孔硅胶型和表面覆盖硅胶型。该型交换剂不耐酸、碱，只能在pH值2～7范围内使用。

3)螯合树脂。该类树脂具有良好的选择性。

(2)按交换树脂释放和交换的离子种类可分为4种。

1)阳离子交换树脂。强酸性阳离子交换树脂，如带磺酸基团；弱酸性阳离子交换树脂，如带羧酸基团。

2)阴离子交换树脂。强碱性阴离子交换树脂，如带叔胺或季胺基团。

3)弱碱性阴离子交换树脂，如带伯胺基团。

4)螯合树脂。带有配位功能基团，其配位基团能与许多金属离子形成螫合物 。

离子交换色谱的固定相表面含有(如SO3^-、COO^-、NH₃ 等)离子官能团，因此带有电荷。这种电荷被流动相中的相反电荷的离子中和。当样品进入色谱柱后，样品离子便与流动相离子相互竞争固定相表面的电荷位置，并因竞争力的差异使样品组分得到分离。

离子交换分离色谱的关键是要控制样品离子与流动相离子对固定相表面电荷位置的竞争作用。为得到最佳的分离条件，可控制以下几个方面的选择：

1)离子交换剂的类型。

2)流动相的pH。

3)流动相的离子强度。

4)流动相中配对离子的类型。

离子交换色谱的固定相是离子交换剂。离子交换剂由聚合物(或硅胶)基体以及与基体相连接的离子交换功能团组成。离子交换色谱通过电荷间的相互作用进行分离，特别适用于分析电离或能电离的化合物。

离子交换色谱的应用范围很广，主要有以下几个方面。 ‘

1、水处理

离子交换色谱是一种简单而有效的去除水中的杂质及各种离子的方法，聚苯乙烯树脂广泛应用于高纯水的制备、硬水软化以及污水处理等方面。纯水的制备可以用蒸馏的方法，但要消耗大量的能源，而且制备量小、速度慢，也得不到高纯度。用离子交换色谱方法可以大量、快速地制备高纯水。一般是将水依次通过H型强阳离子交换剂，去除各种阳离子及与阳离子交换剂吸附的杂质，再通过OH型强阴离子交换剂，去除各种阴离子及与阴离子交换剂吸附的杂质，即可得到纯水。之后通过弱型阳离子和阴离子交换剂进一步纯化，就可以得到纯度较高的纯水。离子交换剂使用一段时间后可以通过再生处理重复使用。

2、分离与纯化小分子物质

离子交换色谱也广泛地应用于无机离子、有机酸、核苷酸、氨基酸、抗生素等小分子物质的分离与纯化。例如对氨基酸的分析，使用强酸性阳离子聚苯乙烯树脂，将氨基酸混合液在pH 2～3时上柱。这时氨基酸都结合在树脂上，再逐步提高洗脱液的离子强度和pH值，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来，可以进行分离鉴定。1958年，人们以离子交换色谱为机理，设计了氨基酸自动分析色谱仪，对多种氨基酸成分进行分离分析。

3、分离与纯化生物大分子物质

离子交换色谱也用于分离与纯化蛋白质等生物大分子物质。如用DEAE一纤维素离子交换色谱法分离与纯化血清蛋白。在离子交换色谱中，基质是由带有电荷的纤维素组成的。当血清蛋白处于一定的pH值条件下时，各蛋白质带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之，阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白质可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来 。2100433B

离子交换是利用一种不溶性高分子化合物，它的分子中具有解离性基团(交换基)，在水溶液中能与溶液中的其他阳离子或阴离子起交换作用。此种交换反应都是可逆的，一般也都是遵循化学平衡的规律。虽然交换反应都是平衡反应，但在色谱柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正反应方向进行，直至完全，因此可以把离子交换剂上的原有离子全部洗脱下来。当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而浓度逐渐减少，因此也可以全部被交换而吸着在交换剂上，根据这一原理可以用离子交换法直接从植物提取液中交换含游离离子基团的酸、碱及两性成分，使与糖类等无游离离子基团的中性物质分开，而被吸着的物质也可用另一洗脱液洗脱下来，这就是常用的离子交换法。

如有两种以上的成分被吸着在离子交换剂上，用另一洗脱液洗脱时，它们的被洗脱能力取决于各物质洗脱反应的平衡常数，利用物质“吸附”及“解吸附”能力的不同进行分离即为离子交换色谱。

离子交换色谱法大部分采用合成离子交换剂。一种是单体在聚合前本身就含有交换基团，另一种是首先形成聚合物，然后引进交换基团。其中用途最广的是离子交换树脂。另外也有在纤维素或多聚糖上人工引入交换基团所成的离子交换剂。大多用于植物大分子蛋白质、核酸、酵素及多糖体的分离精制。

离子交换色谱法的固定相为离子交换剂，常用的有离子交换树脂和化学键合离子交换剂。经典离子交换色谱法的固定相为离子交换树脂，其缺点是易于膨胀，传质较慢，柱效低。不耐高压。HPLC中的固定相是键合在薄壳型和多孔微粒硅胶上的离子交换剂，其机械强度高，不溶胀，耐高压，传质快，柱效高。

离子交换色谱法的流动相是具有一定pH值和离子强度的缓冲溶剂，或含有少量有机溶剂，如乙醇、四氢呋喃、乙腈等，以提高色谱选择性。

离子交换色谱主要是用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离，在生物化学领域得到了广泛的应用。