离心柱层析法

液相色谱法是生化研究中最常用的 分离分析方法之-。而柱层析系统仪器则是液相分离分析不可色缺少的装置。这套仪器-般应包括下列仪器:能获得洗脱溶剂按一定要求改变其浓度的梯度混合器;能驱使溶剂 按恒定流速流过柱体的恒流输液泵(例如蠕动泵);能检测并记录柱体流出液浓度变化的各 种检测据以及能定容、定时或计滴收集各部分的部分收集器。如再月一台程序控制器(或微 机系统)定时地起动和终止上述各部件工作，并控制电磁阀以切换溶剂的种类及流路，就可 按需要的任何方式组合成一套自动(或半自动比)的液相层析装置。这套系统装置的示意图 见图3.1。

硅胶柱层析原理

硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。

硅胶柱层析流动相

极性小的用乙酸乙酯:石油醚洗脱;极性较大的用甲醇:氯仿洗脱;极性大的用甲醇:水:正丁醇:醋酸洗脱;拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸

硅胶柱层析惯用方法

称量。200-300目硅胶，称30-70倍于上样量;如果极难分，也可以用100倍量的硅胶H。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。搅成匀浆。加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌。如果洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油醚拌;如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿拌。如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯/丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥。氯仿用无水氯化钙干燥，以除去1%的醇。如果样品对酸敏感，不能用氯仿体系过柱。装柱。将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约1/3体积石油醚(氯仿)，装上蓄液球，打开柱下活塞，将匀浆一次倾入蓄液球内。随着沉降，会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油醚(氯仿)将其冲入柱中。压实。沉降完成后，加入更多的石油醚，用双联球或气泵加压，直至流速恒定。柱床约被压缩至9/10体积。无论走常压柱或加压柱，都应进行这一步，可使分离度提高很多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂。上样。干法湿法都可以。海沙是没必要的。上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面。过柱和收集。柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡。太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱。收集的例子:10mg上样量，1g硅胶H，0.5ml收一馏分;1-2g上样量，50g硅胶(200-300目)，20-50ml收一馏分。检测。要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的灵敏度一般比喷显剂底1-2个数量级。送谱。收集的产品旋干，在送谱前通常需要重结晶。如果样品太少或为液体，可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段。可除去氢谱1.5ppm左右所谓的"硅胶"峰。