硫色素荧光反应

取当天配制的1.0%铁氰化钾溶液4.0ml，加3.5mol/L的氢氧化钠溶液制成100ml，于4h内使用。

精密称取维生素Bl对照品约25mg，溶于300ml的稀醇溶液(1→5)，用3mol/L盐酸溶液调节至pH4.0，加稀醇稀释成1000ml，作为贮备液。避光冷藏，每月配制一次。取贮备液适量，用0.2mol/L盐酸溶液逐步定量稀释至0.2µg/ml的溶液。

取供试品适量，用0.2mol/L盐酸溶液溶解制成100µg/ml的溶液(若供试品难溶，可在水浴上加热使溶解)，精密量取5ml，逐步定量稀释至0.2µg/ml的溶液。

取40ml具塞试管(或其他合适容器)3支或3支以上，各精密加入对照品溶液5ml，于其中2支(或2支以上)试管中迅速(1~2s内)加入氧化剂各3.0ml，在30s内再加入异丁醇20.0ml，密塞，剧烈振摇90s。于另一文试管中加3.5mol/L 氢氧化钠溶液3.0ml以代替氧化试剂，并照上述方法操作，作为空白。

另取3支或3支以上的相同试管，各精密加入供试品溶液5ml，照上述对照品溶液管的方法，同法处理。

于上述6支或6支以上试管中，各加入无水乙醇2ml，旋摇数秒钟，待分层后，取上层澄清的异丁醇液约10ml，置荧光计测定池内，测定其荧光强度(荧光计的输入和输出的最大波长分别为365nm和435nm)。

5ml供试品溶液中维生素B1的µg数=(A﹣b)/(S﹣d)×0.2×5

式中，A和S分别为供试品溶液和对照品溶液侧得的平均荧光读数;b和d分别为其相应的空白读数;0.2为对照品溶液的浓度(µg/ml);5为测定时对照品溶液的取样体积(ml)。

维生素B1结构中噻唑环在碱性介质中可被高铁氰化钾等氧化剂氧化，然后与嘧啶环上的氨基(-NH2)缩合生成具有荧光的硫色素，后者易溶于异丁醇中显强烈的蓝色荧光，该反应又称为硫色素荧光反应。此反应为维生素B1所特有，也是其专属检测分析反应

维生素B1在碱性溶液中被铁氰化钾氧化成硫色素，用异丁醇提取后，在紫外光(λex365m)照射下呈现蓝色荧光(λem435m)。通过与对照品比较荧光强度，即可求得供试品含量。

(1)硫色素反应为维生素Bl的专属反应，虽非定量完成，促在一定条件下形成的硫色素与维生素Bl浓度成正比，且回收恒定。故可用于维生素Bl及其制剂的含量测定。

(2)本法为维生素B1所特有，故不受氧化破坏产物的干扰，测定结果较为准确。但操作繁琐，且荧光测定受多种因素干扰;

(3)本法中使用的氧化剂，除铁氰化钾外、尚可用氯化汞或溴化氰。其中，溴化氰能将维生素Bl完全定量地氧化为硫色素，在较宽的浓度范围内与荧光强度成正比，且尿液中某些代谢产物不干扰测定。故亦适用于临床体液分析。