环介导等温扩增技术应用

细菌类病原微生物的检测，病毒类病原微生物的检测，真菌类微生物的检测，现场病原寄生虫的检测，转基因产晶成分检测

LAMP 技术虽然是一种新的核酸扩增技术，但其在分子生物学检测领域的应用非常广泛，相对于现有的其他核酸扩增技术， LAMP 具有许多独特的优点：

（1） LAMP 技术可以在等温条件下实现扩增，不需要进行模板的预变性，减少了PCR 技术升降温带来的影响以及对昂贵、精密实验仪器的要求，同时扩增效率高，可以在1 h 内把几拷贝的目的序列迅速扩增到10 拷贝；

（2) LAMP 技术分别使用一对外部引物和一对内部引物，可以识别目的序列上6个不同的区域，对目的序列具有高度的选择性，减少了非靶标序列的影响，因此扩增的特异性非常高；

（ 3 ）阳性扩增反应中会产生大量的类似花椰菜结构的产物和白色焦磷酸续沉淀，扩增产物的检测方法多样，可用凝胶电泳检测、直接用肉眼检测或在反应体系中加人染料，根据颜色的变化进行检测，还可以利用浊度仪，根据扩增产物混浊度的不同对原始核酸分子进行实时定量分析。此外，对于某些病原体可直接利用简单处理的样本作为模板，省略繁琐的DNA/RNA 提取步骤。综上所述， LAMP 技术因其快速、高效、特异、灵敏和经济等优点，已经应用于病原菌、寄生虫、病毒、疾病和转基因产品检测等领域，并且还将广泛应用于临床诊断、环境监测、食源安全等领域，具有更为广阔的发展应用前景。

2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术英文名称为"Loop-mediated isothermal amplification"。短短几年，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在2009年甲型H1N1流感事件中，日本荣研化学株式会社(以下简称"荣研公司")接受WHO的邀请完成了H1N1环介导等温扩增法检测试剂盒的研制，通过早期快速诊断对防止该病症的快速蔓延起到积极作用。通过荣研公司近十年的推广，环介导等温扩增技术已广泛应用于日本国内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。该技术的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，环介导等温扩增反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。

目前国内基因诊断常采用PCR方法，涉及到PCR仪，该仪器价格国产和进口价格不一，便宜的2~3万也能买到，贵的20多万。条件比较好的实验室和国家机构也有尝试荧光定量PCR方法的，该方法技术含量高，必须使用荧光定量PCR仪，价格在20~70万不等。

使用环介导等温扩增技术的产品在临床诊断中是不需要特殊仪器的，但临床使用的成品试剂盒在研发过程中由于涉及引物的选择，引物浓度的调整，及反应温度和时间的优化，需要用一种量化的方式去帮助研究者分析选择数据，因此我们推荐使用荣研公司的专利产品LA-320C或LA-500实时浊度仪。

环介导等温扩增法，英文名称为loop-mediatedisothermal amplification，，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60--65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现10^9~10^10倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在DNA合成时，从脱氧核糖核酸三磷酸底物(dNTPs)中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色。因此，可以把浑浊度作为反应的指标，只用肉眼观察白色浑浊沉淀，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于环介导等温扩增反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。