高效液相色谱柱

高效液相色谱柱填充剂的要求

最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换色谱系统使用离子交换填充剂；分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。

填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。孔径在15nm（1nm=10Å）以下的填料适合于分析分子量小于2000 的化合物，分子量大于2000 的化合物则应选择孔径在30nm 以上的填料。除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3μm~10μm 之间。粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm），使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。

高效液相色谱柱温度的要求

以硅胶为载体的普通键合固定相的使用温度通常不超过35℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不能超过60℃。

高效液相色谱柱流动相的要求

流动相的pH 值应控制在2～8 之间。当pH 值大于8 时，可使载体硅胶溶解；当pH 值小于2 时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH 值大于8 的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机-无机杂化填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用pH 值小于2 的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂，或有机-无机杂化填充剂等。

1、柱压过高

可能是微粒堵塞． 柱床膨胀，不可逆吸附， 细菌生长等造成的。也有可能是系统反压问题， 例如阻尼器堵塞，进样器堵塞， 管路或连接口堵塞。 在线过滤器不干净， 压力传感器不准确等。

2、柱效低

可能是色谱柱被污染、 过滤片部分堵塞、色谱柱内的死体积造成，例如流动相pH值或者组成不合适造成固定相损失。 流动相急剧变化造成固定相物理损坏， 机械振动造成固定相产生裂缝，柱床收缩或干枯。也有可能是仪器连接的问题， 认真检查进样器、检测器、 管路、 保护柱和在线过滤器等是否连接好，也可能是色谱柱没有平衡好， 进样量过大等问题。

3、重复性差、不出峰、回收率低

可能是色谱柱被污染， 流动相 pH值或者组成不合适造成固定相损失 ， 样 品溶剂 不同或样品本身不稳定， 固定 相极性过强或者流动相极性过弱． 或者发生非特异性吸附。也可能梯度实验时平衡时间不足，温度波动， 流动相组成改变， 样品溶剂不同， 样品稳定性不好，方法的开发不好， 缓冲液的酸碱度不合适或者缓冲能力不足。2100433B

液相色谱柱的结构：

a、空柱由柱接头、柱管及滤片组装而成。

柱接头采用低死体积结构，柱接头是两端螺纹组件，一端是为7/16英寸内螺纹，另一端是3/16英寸的内螺纹（国内外已规范化）。7/16英寸内螺纹与1/4英寸柱管（Φ6.35mm）连接，中间放置压环用于密封。3/16英寸的内螺纹与1/16英寸（Φ1.57mm）的连接管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ1.57mm连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上（连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在2．5mm长或其他固定尺寸）。

在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片（或滤网），用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。空柱各组件均为316L不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。

b、柱填料：

液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。

正相柱：多以硅胶为柱填料。根据外型可分为无定型和球型两种，其颗粒直径在3—10 μm的范围内。另一类正相填料是硅胶表面键合—CN，-NH₂等官能团即所谓的键合相硅胶。

反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团（ODS）的非极性填料。也有无定型和球型之分。

常用的其他的反相填料还有键合C8、C4、C2、苯基等，其颗粒粒径在3—10 μm之间。

高效液相色谱柱柱效和保护柱

拿到一根新柱时，一定要先看其使说明，然后测柱效，定期检测柱效， 保留在新色谱柱上得到的色谱图，并记录条件， 定期检测仪器的谱带展宽。 若应用于在线监测， 应对色谱柱提供在线的物理保护和化学保护， 例如采取安装在线过滤器， 自装填料保护柱和预装保护柱等。在线过滤器的作用是防止颗粒在柱头累计，优点是基本不影响柱效， 在需要高柱效的时候常用， 常更换的消耗品是滤芯和垫圈保护柱的作用是防止柱子被化学污染。缺点是多数保护柱影响色谱柱的柱效， 特别是在用微柱时，常用的是普通 自装填料的保护柱。最近新出的一些保护柱例如Sentry—guard保护柱， 它的特点是高质量、高效填料、 增加分析柱效、对脏样品载荷能力大 ，能延长保护柱的寿命，手可拧紧接头，安装时不需要工具，省时省，可换芯式设计，能采用各种不同的填料，主要适用于非常脏非常复杂的样品本底，例如生化样品，环境样品和食品等，或者不想做太多的圃相萃取，不想降低柱效果等情况。

高效液相色谱柱清洗

对所做的样品要有充分的了解，用对该样品洗脱能力最强的流动相清洗，对于硅胶柱，先用甲醇洗去极性杂质，然后用干燥的二氯甲烷和正庚烷 100 — 20OraL依次活化，对于键和相柱，一般用甲醇一氯仿一甲醇一水依次冲洗，每种色谱柱有特定的清洗方法，一定要看其使用说明。

高效液相色谱柱存放

存放前除去杂质和盐，采用合适的存放溶剂，避免色谱柱床的干枯，避免机械振动，防止细菌生长，注意存放的温度。