分离胶

(一)将分离胶瓶子倒置用力上下摇晃几次，肉眼看瓶底无明显沉淀，然后倒入刷胶的容器内待用。

(二)将配好页的无碳复写纸商业表格按顺序上下排列挫齐，用机刀将预刷胶端面光(切)齐，将纸堆叠起来，高一般在20~30厘米，不得超过50厘米，保证刷胶后，纸边易吸收、干燥，分离效果好。

(三)将一硬块 (塑料板或木板)，放于摞好的纸面上，面积最好能覆盖整张纸的大小，然后将硬块沿欲涂胶的边沿后退0.2~1.0厘米，保证所刷纸边不移动即可。

(四)用细软毛刷 (羊毛刷最好)沾取适量的分离胶，沿刷胶部自下而上水平方向快速刷胶，以纸边不"吸胶"为准，一般为两遍胶 (目测刷胶部位挂胶)，刷胶后即可将盖板后移2厘米，保持胶快速吸收均匀。

(五)根据纸的渗透情况，静置一定时间(15一50分钟)，用手触摸刷胶部是否己近干燥，若干燥，将成叠纸拿起轻轻拍打刷胶面，检查分离效果(此时，份与份之间自动的分离，每份之间的联数粘接牢固，不脱页)。

(六)若分离效果好，待完全干燥后再进行后续加工:若分离效果不理想，查找原因。

(一)在室温15~30℃，相对湿度60%以下，刷胶后的纸边自然吸收反应时间缩短，一股15~30分钟左右分离好;若室温低于15℃(如冬季12月至3月份)，湿度大于60%(夏季)，刷胶后的纸边自然吸收反应时间延长，一般30~50分钟，才能达到最佳分离效果。

(二)若室内温度低于15℃或相对湿度大于60%刷胶后的纸边自然吸收反应肘间长，影响后序加工时，可采取先将刷胶后的纸样静置30分钟，用热风吹拂(注意不要离刷胶部位太近直吹，防止吹裂)加速纸边的快速吸收反应，也能达到自动分离效果。(不能刷胶后立即用热风吹拂，分离胶与纸的涂层需要一定时间的接触反应。)

(三)在使用分离胶时，务必在印刷品切边后立即刷胶;4~8小时后刷胶，分离效果会明显变差，隔日效果更差

(四)因涂胶量不合适或刷胶不均匀(操作生疏)造成的分离效果不好时，必须重新切去刷胶纸边1至2毫米后，再重新刷分离胶。

(五)使用分离胶时，务必保证刷胶纸边吸胶均匀;满足所需的干燥时间(若纸边潮湿就检查分离效果会导致脱页或裂口)。

(六)分离胶室内保存一般不低于半年。

(一)无碳复写纸平板成套印刷品。

(二)每套印刷表格配页格式永远是上页纸CB、中页纸CFB、下页纸CF，按每份所需联数配好，即CB+nCFB+CF(其中n=O，1，2，3，……自然数)。

凝胶的制备:

凝胶由分离胶和浓缩胶组成:上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效应，其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分辨率。下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，pH为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。

制备顺序为先灌制分离胶，然后在分离胶上灌制浓缩胶: (四人一组)

1. 在两块玻璃板间夹以垫条，用手夹住玻璃板放入电泳槽主体内，缺口朝外，再插入斜楔板。

2. 拿一小烧杯，按下表加入各试剂: (12%分离胶)

3. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入两玻璃板间，灌注高度为红色背景下沿线。然后滴上少量水饱和异丁醇，静置约15分钟。

4. 待凝胶与异丁醇出现分层时，倒去异丁醇，用洗瓶冲洗凝胶顶部，然后拿一烧杯，按下表加入各试剂: (4%浓缩胶)

5. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入已制好分离胶的玻璃板间，灌满后，小心插入梳子，静置30分钟。

6. 待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。小心取出玻璃板，取掉垫条后，缺口朝内放入电泳槽主体，插入斜楔板。 两组用一个电泳槽主体，两组玻璃板间即为上槽。

7. 装好的电泳槽主体放入下槽，往上下槽加入 Tris-甘氨酸电极缓冲液。用滴管冲洗凝胶顶部，并赶走底层的气泡。

样品制备

蛋白质样品需变性并结合SDS，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物。四人一组，取一1.5离心管，加入30ul鼠IgG样品和30ul样品缓冲液，混匀后沸水浴5分钟，3000rpm离心数秒，每人取10ul加样。

电泳

连接电泳仪，选择电压为40伏，蓝色指示剂移动至凝胶底部即停止电泳。取出玻璃板，用保鲜膜包好，置冰箱待明日做蛋白印渍(Western-Blotting)。

SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳操作流程

1.将玻片装置搭建起来，加水静置，检查是否有渗漏。

2.配制分离胶 加入2玻片间，加时尽量减少气泡，由玻片一端连续、快速、均匀的注入，可适当摇晃，使得分离胶上界面尽量水平;加保护液(0.1% SDS)静置凝聚。加保护液时，枪头应均匀扫过玻片上沿，切不可由一端注入。

3.配制浓缩胶 待分离胶凝固后，去除保护液，依同样方法加入上层浓缩胶，并插入梳齿模具，静置。插入模具后，加少许浓缩胶，补平液面 。

4.配制电泳缓冲液，浓缩胶凝固后，玻片取下，放入电泳槽中，有凹陷玻片朝向内侧，并将玻片用夹子夹紧，在外侧玻片粘上凹槽指示薄片，取下梳齿，加入电泳缓冲液，平板内侧液面以刚没过凹槽上沿为宜。

5.样品处理 将待分析样品配制成合适的浓度或浓度梯度溶液，连同marker分装于Ep管中，并加入loading buffer ，100℃煮沸。此步可调至步骤3后做，一般4完成后不宜等待过长时间，最好立即加样、通电。

6.将样品液依次加入梳齿形胶孔中，每孔上样量10ul。

7.接通电源，设为恒流10 mA，待样品跑至分离胶界面后，调整电流为15 mA。

8.胶跑完后，固定(0.5h~)、染色(1.5h~)、脱色。