电泳缓冲液

50×TAE Buffer 配制方法:

1。称量氨基丁三醇 242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L烧杯中;

2。向烧杯中加入约600ml去离子水，充分搅拌均匀;

3。加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解;

4。用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。

使用时稀释50倍 即1×TAE Buffer

10×TBE Buffer配制方法:

1。称量氨基丁三醇 108g，Na2EDTA.2H2O 7.44g，硼酸55g 于1L烧杯中;

2。加入约700ml去离子水，搅拌均匀;

3。用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。

使用时稀释10倍 即1×TBE Buffer

电泳缓冲液是指在进行分子电泳时所使用的缓冲溶液，用以稳定体系酸碱度。常见的核酸电泳缓冲液有:TAE、TBE、TPE和MOPS等。

缓冲液在电泳过程中的一个作用是维持合适的pH。电泳时阳极与阴极都会发生电解反应，阳极发生的是氧化反应(4OH--4e->2H2O+O2)，阴极发生的是还原反应(4H++4e->2H2)，长时间的电泳将使阳极变酸，阴极变碱。一个好的缓冲系统应有较强的缓冲能力，使溶液两极的pH保持基本不变。

电泳缓冲液的另一个作用是使溶液具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁移，例如，一般电泳缓冲液中应含有0.01-0.04mol/L的Na+离子，Na+离子的浓度太低时电泳速度变慢;太高时就会造成过大的电流使胶发热甚至熔化。

电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。

TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量(TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量)，且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳(如过夜)不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。

TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。

TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。

1. 材料:植物总RNA 5-10 μg

2. 试剂

(1)加样运载缓冲液(Loading buffer)

50% 甘油

1 mmol/L EDTA (pH8.0)

0.25%溴酚蓝

25%二甲苯氰FF

(2)10×TAE Buffer

(3)5×甲醛凝胶电泳缓冲液:

0.1 mol/L MOPs (pH7.0)

40 mmol/L乙酸钠

5 mmol/L DETA(pH8.0)

(4)甲醛，甲酰胺

3. 仪器:电泳装置，紫外透射观测仪

1、PAGE胶电泳缓冲液配置

1)丙烯酰胺单体贮液:14.55g丙烯酰胺加上0.45g N，N'-甲叉双丙烯酰胺，先用40mL双蒸水搅拌溶解，直到溶液变成透明，再用双蒸水稀至50mL，过滤。用棕色瓶4°C保存备用。

2)浓缩胶缓冲液贮液(0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8):3.03gTris溶解在40mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调pH6.8。再用双蒸水稀至50mL。保存在4°C备用。

3)分离胶缓冲液贮液(1.5mol/L Tris-HCl，pH8.9):18.16gTris溶解在80mL双蒸水中，用4mol/L盐酸调pH8.9。再用双蒸水稀至100mL，保存在4°C备用。

4)10%(AP)过硫酸铵:0.1g过硫酸铵溶入1.0mL双蒸水，使用前新鲜配制。

5)电极缓冲液(0.025mol/L Tris，0.2mol/L甘氨酸，pH8.3):15.14gTris加上72.07g甘氨酸，用双蒸水稀释到5L。可在室温保存一个月。

6)样品缓冲液(0.1mol/L Tris-HCl，pH6.8):2ml浓缩胶缓冲液贮液加上1mL87%甘油、0.1mg溴酚蓝，用双蒸水稀释至10mL，可在-20°C保存6个月。

2、Native-PAGE配方

3、Native-PAGE电泳

将玻璃板、胶垫、梳子用双蒸水洗干净，用酒精棉球擦拭，将电泳槽安装好，配制分离胶(12%)和浓缩胶(5%)如表1。过硫酸铵和TEMED最后加入，加入后聚合即开始，应立即混匀倒入两块玻璃板之间。分离胶倒入两块玻璃板间，应该留下适合的高度，使点样孔前端离分离胶有2.5cm左右的距离，在胶顶部缓缓加入约0.5cm高的双蒸水，待分离胶聚合完全后，倾去上层的双蒸水，用双蒸水清洗凝胶顶层，用吸水纸吸去残余的水滴。将浓缩胶倒入玻璃板夹层，插上梳子，待浓缩胶聚合完全后，拔去梳子，立即用双蒸水清洗点样孔。加入电极缓冲液，将样品用微量进样器点入点样孔底部，200伏电泳。当溴酚蓝到达分离胶时，电压改为250伏，继续电泳至溴酚蓝到达凝胶底部。将凝胶剥下，浸泡在100ml的底物液中，染色1小时，待胶带显色后立即照相。然后将凝胶进行常规的考马斯亮蓝染色。

⒈ 配胶缓冲液系统对电泳的影响?

在SDS-PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris-HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9;而电泳缓冲液使用的Tris-甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低;而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。

所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。

⒉ 样品如何处理?

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法:还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。

1)还原SDS处理:在上样buffer中加入SDS和DTT(或β-巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。

2)带有烷基化作用的还原SDS处理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3)非还原SDS处理:生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

⒊ SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用?

聚丙烯酰胺的作用:丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关;

制胶缓冲液:浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择Tris-HCl系统，TEMED与AP:AP 催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝剂，加速AP催化作用;十二烷基硫酸钠(SDS):阴离子去污剂，作用有四:去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

⒋ 提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径?

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法:待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

⒌" 微笑"(两边翘起中间凹下)形带原因?

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法:待其充分凝固再作后续实验。

⒍ "皱眉"(两边向下中间鼓起)形带原因?

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法:可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

⒎ 为什么带出现拖尾现象?

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。此外可能是灌胶时分离胶过多导致浓缩胶很少，不能起到浓缩作用，没有把样品压成一条线。

处理办法:加样前离心;选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂;电泳缓冲液时间过长，重新配制;降低凝胶浓度;灌胶时分离胶不要过多。

⒏ 为什么带出现纹理现象?

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法:加样前离心;加适量样品促溶剂。

⒐ 什么是"鬼带"，如何处理?

"鬼带"就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法:在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂;或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

⒑ 为什么溴酚蓝不能起到指示作用?

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。

处理办法:更换正确pH值的Buffer;降低分离胶的浓度。

⒒ 为什么电泳的条带很粗?

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法:适当增加浓缩胶的长度;保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7);适当降低电压;

⒓ 为什么电泳电压很高而电流却很低呢?

这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括:a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。

处理办法:电泳槽正确装配即可。

⒔ 浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?

这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致;后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

⒕ 凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事?

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

⒖ 电泳时间比正常要长?

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

⒗分离胶加上后为什么要立即加水?

加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上;二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

⒘连续分离胶体系配制(凝胶板厚度0.75mm，长度10cm)100ml体系:双蒸水37.5ml

尿 素20--50g

10×TBE缓冲液8ml

30%丙烯酰胺10ml

APS(过硫酸铵)500--800ul [注:现配现用]

TEMED(四甲基乙二胺) 23.5ul