车萝卜

β-胡萝卜素在食品、药品和化妆品领域有广泛用途。为获得生产β-胡萝卜素的微生物细胞工厂,本研究首先在酿酒酵母BY4742中过表达甲羟戊酸（MVA）途径的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）基因及二萜化合物合成的关键酶牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶（GGPS）基因,来提高牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸（GGPP）的供给。在酿酒酵母底盘菌BY4742-T2的基础上整合来源于成团泛菌和红法夫酵母的β-胡萝卜素合成基因,比较酿酒酵母工程菌生产β-胡萝卜素的差别。结果表明提高酿酒酵母中HMGR和GGPS酶基因的表达能将工程菌中β-胡萝卜素的产量提高26.0倍。另外,来源于真核生物红法夫酵母的合成基因相比成团泛菌,更有利于酿酒酵母生产β-胡萝卜素。最终获得的酿酒酵母工程菌BW02能生产1.56 mg/g细胞干重的β-胡萝卜素,为进一步获得高产β-胡萝卜素细胞工厂提供基础。

甘油是生物柴油的副产物,因其价格低廉和高还原性,成为生物发酵的重要碳源.为了进一步提高工程菌对甘油的利用能力,从而提高萜类化合物的合成能力,本研究从β-胡萝卜素高产菌CAR015出发,对其甘油代谢途径的多个基因进行了调控.首先敲除了编码3-磷酸甘油抑制子的glpR基因,然后分别用M1-37、M1-46和M1-93三个不同强度的人工调控元件对glpFK,glpD和tpiA三组基因进行单基因调控和多基因组合调控.研究发现用M 1-46调控glpD基因后p-胡萝卜素产量达到了64.82 mg/L,是CAR015的4.86倍,甘油消耗速率也提高了100％;调控tpipA基因后β-胡萝卜素产量略有提高;调控glpFK基因后p-胡萝卜素产量略有降低.说明G1pD是甘油代谢途径中的关键限速步骤.Q-PCR结果表明,降低甘油代谢途径的glpD和glpFK基因转录水平,增加tpiA基因转录水平,可以增加细胞生长速度、提高β-胡萝卜素产量,可能是因为减少了丙酮醛毒性所致.组合调控glpD和tpiA基因,获得β-胡萝卜素产量最高菌株Gly003,其p-胡萝卜素产量达72.45 mg/L,产率达18.65 mg/g每克干细胞,分别是出发菌株CAR015的5.23倍和1.99倍.总之,GlpD是甘油代谢途径中的关键限速步骤,适当强度调控glpD,可以有效提高重组大肠杆菌的p-胡萝卜素产量.