变性聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳实验步骤

凝胶的制备:

凝胶由分离胶和浓缩胶组成:上层为浓缩胶，凝胶孔径较大，没有分子筛效应，其pH为6.8，由于快慢离子所形成的高电压梯度，使得变性蛋白质分子在泳动中被压缩为很薄的一层，大大提高了分辨率。下层为分离胶，凝胶孔径较小，有分子筛效应，pH为8.8，变性蛋白质分子所带负电荷基本一致，泳动速度主要决定于分子量。

制备顺序为先灌制分离胶，然后在分离胶上灌制浓缩胶: (四人一组)

1. 在两块玻璃板间夹以垫条，用手夹住玻璃板放入电泳槽主体内，缺口朝外，再插入斜楔板。

2. 拿一小烧杯，按下表加入各试剂: (12%分离胶)

3. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入两玻璃板间，灌注高度为红色背景下沿线。然后滴上少量水饱和异丁醇，静置约15分钟。

4. 待凝胶与异丁醇出现分层时，倒去异丁醇，用洗瓶冲洗凝胶顶部，然后拿一烧杯，按下表加入各试剂: (4%浓缩胶)

5. 上述溶液混匀后，用滴管迅速加入已制好分离胶的玻璃板间，灌满后，小心插入梳子，静置30分钟。

6. 待浓缩胶凝固后，小心拔出梳子。小心取出玻璃板，取掉垫条后，缺口朝内放入电泳槽主体，插入斜楔板。 两组用一个电泳槽主体，两组玻璃板间即为上槽。

7. 装好的电泳槽主体放入下槽，往上下槽加入 Tris-甘氨酸电极缓冲液。用滴管冲洗凝胶顶部，并赶走底层的气泡。

样品制备

蛋白质样品需变性并结合SDS，形成所带负电荷相对一致的非折叠衍生物。四人一组，取一1.5离心管，加入30ul鼠IgG样品和30ul样品缓冲液，混匀后沸水浴5分钟，3000rpm离心数秒，每人取10ul加样。

电泳

连接电泳仪，选择电压为40伏，蓝色指示剂移动至凝胶底部即停止电泳。取出玻璃板，用保鲜膜包好，置冰箱待明日做蛋白印渍(Western-Blotting)。

PAM沉淀的技术流程

沉淀是发生化学反应时生成了不溶于反应物所在溶液的物质。从字意上理解就是在重力作用下沉淀去除。污水中的悬浮物质，可以这是一种物理过程，简便易行，效果良好，是污水处理的重要技术之一。

根据悬浮物质的性质、浓度及聚丙烯酰胺絮凝性能，沉淀可以分为:自然沉淀，絮凝沉淀，区域沉淀。域沉淀的悬浮颗泣浓度较高(5000mg/L以上)，颗粒的沉降受到周围其它颗粒影响，颗粒间相对位置保持不变，形成一个整体共同下沉，与澄清水之间有清晰的泥水界面。二次沉淀池与污泥浓缩池中均有区域沉淀发生。

废水中悬浮固体浓度不高，而且不具有凝聚的性能，在沉淀过程中，固体颗粒不改变形状，也不互相粘合，各自独立地完成沉淀过程，(沉砂池和初沉池的初期沉淀)压缩沉淀发生在高浓度悬浮颗粒的沉降过程中，由于悬浮颗粒浓度很高，颗粒相互之间已挤集成团块结构，互相接触，互相支承，下层颗粒间的水在上层颗粒的重力作用下被挤出，使污泥得到浓缩。二沉池污泥斗中的聚丙烯酰胺浓缩过程以及在浓缩池中污泥的浓缩过程存在压缩沉淀。自由沉淀发生在水中悬浮固体浓度不高，沉淀过程悬浮固体之间互不干扰，颗粒各自单独进行沉淀，颗粒的沉淀轨迹呈直线。整个沉淀过程中，颗粒的物理性质，如形状，大小及比重等不发生变化。这种颗粒在沉砂池中的沉淀是自由沉淀。

絮凝沉淀是颗粒物在水中作絮凝沉淀的过程。在水中投加混凝剂后，其中悬浮物的胶体及分散颗粒在分子力的相互作用下生成絮状体且在沉降过程中它们互相碰撞凝聚，其尺寸和质量不断变大，沉速不断增加。悬浮物的去除率不但取决于沉淀速度，而且与沉淀深度有关。地面水中投加混凝剂后形成的矾花，生活污水中的有机悬浮物，活性污泥在沉淀过程中都会出现絮凝沉淀的现象。

用途

1. 用于污泥脱水根据污泥性质可选用本产品的相应型号，可有效在污泥进入压滤之前进行污泥脱水，脱水时，产生絮团大，不粘滤布，压滤时不散，流泥饼较厚，脱水效率高，泥饼含水率在80%以下。

2. 用于生活污水和有机废水的处理，本产品在配性或碱性介质中均呈现阳电性，这样对污水中悬浮颗粒带阴电荷的污水进行絮凝沉淀，澄清很有效。如生产粮食酒精废水，造纸废水，城市污水处理厂的废水，啤酒废水，味精厂废水，制糖废水，有机含量高 废水、饲料废水，纺织印染废水等，用阳离子聚丙烯酰胺要比用阴离子、非离子聚丙烯酰胺或无机盐类效果要高数倍或数十倍，因为这类废水普遍带阴电荷。

3. 用于以江河水作水源的自来水的处理絮凝剂，用量少，效果好，成本低，特别是和无机絮凝剂复合使用效果更好，它将成为治长江、黄河及其它流域的自来水厂的高效絮凝剂。

4. 造纸用增强剂及其它助剂。提高填料、颜料等存留率、纸张的强度。

5. 用于油田经学助剂，如粘土防膨剂，油田酸化用稠化剂。

6. 用于纺织上浆剂、浆液性能稳定、落浆少、织物断头率低、布面光洁。

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是根据寡核苷酸的大小来分离，因此可将全长产物与不完整的短分子分开。电泳时通常每一泳道至少加1mg合成的寡核苷酸，电泳后在紫外灯下定位寡核苷酸条带，将长度正确的寡核苷酸从凝胶上切下。

非变性凝胶里面没加变性剂，一般是SDS。非变性胶跑出来的蛋白能保持其活性一般用做功能试验，如EMSA。由于没有变性剂的原因非变性胶电泳时除了与蛋白分子量有关也会受都电荷的影响，因此对蛋白等电点的确定和缓冲液的酸碱性有注意，有时需要倒转电泳时的正负极。从跑的胶来看，变性胶会比较好看，带比较窄，非变性胶跑出来则比较粗糙。

非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为活性电泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等变性剂的条件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于酶的鉴定、同 工酶分析和提纯。未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，它们的分离是依据其电泳迁移率的不同和凝胶的分子筛作用，因而可以得到较高的分辨率，尤其是在电泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，其方法是在凝胶上进行两份相同样品的电泳，电泳后将凝胶切成两半，一半用于活性染色，对某个特定的生物大分子进行鉴定，另一半用于所有样品的染色，以分析样品中各种生物大分子的种类和含量。

非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性SDS-PAGE电泳在操作上基本上是相同的，只是非变性聚丙烯酰胺凝胶的配制和电泳缓冲液中不能含有变性剂如SDS等。一般蛋白进行非变性凝胶电泳要先分清是碱性还是酸性蛋白。分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统，分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。 酸性蛋白通常在非变性凝胶电泳中采用的pH是8.8的缓冲系统，蛋白会带负电荷，蛋白会向阳极移动;而碱性蛋白通常电泳是在微酸性环境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极和阳极倒置才可以电泳分离碱性蛋白。

1. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，蛋白质的迁移率不仅和蛋白质的等电点有关，还和蛋白质的分子量以及分子形状有关，其中蛋白质的等电点是最重要的影响因子，要根据蛋白质的等电点来选择对应的电泳缓冲系统;

2. 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，要注意电压过高引起发热而导致蛋白质变性，所以最好在电泳槽外面放置冰块以降低温度;

3. 蛋白质的分子量较大，则电泳时间可以适当延长，以使目的蛋白质有足够的迁移率和其它的蛋白质分开，反之亦然;

4. 变性样品的离子强度不能太高(I<0.1mM)。上样buffer中没有SDS之外，加入样品后不能加热。