氨基酸等电点氨基酸的浓度测定

1、氨基酸的甲醛滴定（formal titration）

氨基酸等电点原理

氨基酸虽然是一种两性电解质，即是酸性又是碱性，但它却不能直接用酸碱滴定来进行测量。这是因为氨基酸的酸碱滴定的等电点pH过高（12-13）或是过低（1-2）没有适合的指示剂可备选用。而向氨基酸中加入过量的甲醛，用氢氧化钠滴定时，由于甲醛可与氨基酸上的—N H₃结合，形成—NH—CH₂OH、—N(CH₂—OH)₂等羟甲基衍生物，而降低了氨基酸的碱性，相对增强了—N H₃的解离，使滴定终点移到了pH9附近，在酚酞指示剂的变色区域内，能够用酚酞作为指示剂进行滴定。

以上出自《生物化学》（高等教育出版社 2006.5，王镜岩等主编）

氨基酸等电点流程

甲醛滴定法测定氨基酸含量

目的

初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点

原理

水溶液中的氨基酸为兼性离子，因而不能直接用碱滴定氨基酸的羧基。甲醛可与氨基酸上的—N H₃结合，形成—NH—CH₂OH、—N(CH₂—OH)₂ 等羟甲基衍生物，使N H₃上的H 游离出来，这样就可以用碱滴定N H₃放出H ，测出氨基氮，从而计算氨基酸的含量。

若样品中只含有单一的已知氨基酸，则可由此法滴定的结果算出氨基酸的含量。若样品中含有多种氨基酸（如蛋白质水解液），测不能由此法算出氨基酸的含量。

脯氨酸与甲醛作用后，生成的化合物不稳定，导致滴定后结果偏低；酪氨酸含酚基结构，导致滴定结果偏高。

材料、试剂与器具

（一）试剂

1、0.5%酚酞酒精溶液

称0.5g酚酞溶于100ml60%酒精中。

2、0.05%溴麝香草酚蓝溶液

取0.05溴麝行草酚蓝溶于100ml 20%乙醇溶液中。

3、1%甘氨酸溶液

取1g甘氨酸溶于100ml蒸馏水。

4、标准0.100mol/L 氢氧化钠溶液

5、中性甲本醛溶液

取甲醛溶液50ml，加0.5%酚酞指示剂约3ml，滴加0.1mol/LnaOH溶液，使溶液呈微粉红色，临用前中和。

（二）实验器具

1、锥形瓶 2、碱式滴定管

3、 移液管洗耳球 4、天平

5、容量瓶 6、试剂瓶

7、量筒 8、玻棒与烧杯

氨基酸等电点操作步骤

1、取3只100ml锥形瓶，按下表加入试剂

2、混匀后用标准0.100mol/L氢氧化钠溶液滴定至紫色（pH8.7~9.0）

3、结果计算

每毫升氨基酸溶液中含氨基氮的毫克数为

式中：V₁为滴定样品消耗氢氧化钠的体积（ml）；

V₂为滴空白消耗氢氧化钠的体积（ml）；

1.4008 为1ml 0.1mol/L氢氧化溶液相当的氮量（mg）

氨基酸等电点注意事项

利用甲醛滴淀法可以用来测定蛋白质的水解程度。随着蛋白质水解度的增加，滴定值也增加，当蛋白质水解完成后，滴定值不再增加。

1、对于侧链R基不解离的中性氨基酸来说，pI=1/2（pK_a1 PK_a2）。

2、对于有多个解离基团的氨基酸来说，只要写出它的解离公式，然后取等电兼性离子两边的pK_a的平均值则得出其pI值。

注：pI值与该离子浓度基本无关，只取决于等电中性离子A⁰两侧的pK值。

isoeletric point ，pI 定义：

2、氨基酸净电荷为零时的pH值。

3、氨基酸是两性电解质，在碱性溶液中表现出带负电荷，在酸性溶液中表现出带正电荷，在某一定pH溶液中，氨基酸所带的正电荷和负电荷相等时的pH,称为该氨基酸的等电点。

甘氨酸5.97

丙氨酸6.00

缬氨酸5.96

亮氨酸5.98

异亮氨酸6.02

苯丙氨酸5.48

丝氨酸5.68

苏氨酸6.16

酪氨酸5.66

半胱氨酸5.05

蛋氨酸5.74

脯氨酸6.30

色氨酸5.89

赖氨酸9.74

精氨酸10.76

组氨酸7.59

天冬氨酸2.77

谷氨酸3.22

天冬酰胺5.41

谷氨酰胺5.65

出自《有机化学》（高等教育出版社 2004.11，曾昭琼主编）