SRB检测方法

2.SRB检测的操作步骤

1)细胞固定:药物作用时间终点时，每孔加入50μL4℃预冷的TCA溶液(30%，w/v)固定细胞，TCA溶液的终浓度为10%。静置5 min移入4℃冰箱中固定1 h，取出用去离子水冲洗5遍，室温晾干。

2)染色:待96孔板室温下晾干后，每孔加入0.4%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制)70μL，染色30 min后倒掉染液，用1%(v/v)乙酸冲洗4次，去除未结合的染料，室温晾干。

3)检测:用100μL非缓冲Tris-base碱液(10mM，pH=10.5)溶解与细胞蛋白结合的染料，水平摇床上振荡20min，采用酶标仪540nm处测定光吸收值。操作中，应注意洗除染料时操作需迅速，避免用移液器吸取液体，防止动作过慢造成与细胞蛋白结合的染料解吸附。

3.SRB检测的计算公式

根据美国国立癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)关于SRB检测的介绍，细胞增殖百分率的计算存在以下两种情况:

1)Tx-T0>0，

PG=100×(Tx-T0)/(C-T0)

2)Tx-T0<0，

PG=100×(Tx-T0)/T0

其中，

T0:药物作用前的细胞经过固定、染色后测得平均吸光值;

C:培养基中加有等体积的DMSO，没有药物作用的阴性对照的平均吸光值(阴性对照);

Tx:药物作用终点时细胞经过固定、染色后测得平均吸光值。

PG即Percentage Growth，是指药物作用的样品孔与阴性对照孔中细胞增殖量的百分率。

1.SRB检测方法的原理

磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B，SRB)比色法，主要用来检测细胞增殖情况。SRB是一种粉红色阴离子染料，易溶于水，在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合;在540 nm波长下产生吸收峰，吸光值与细胞量成线性正相关，故可用作细胞数的定量检测。SRB染色后不会像MTT法那样很容易变色，细胞固定染色后在96孔板中可以放置较长时间，因而受测定时间的影响较小。用Tris-base溶液溶解的SRB也可稳定较长时间。因此不同时间点固定的96孔细胞培养板可在同一时间测定，测定的吸光值结果不会受到明显影响。吸光值与SRB浓度作图时，在OD单位1.5-2.0以下为线性，当超出线形范围时，最好稀释后重新读数。虽然SRB法比其他检测方法操作步骤繁琐，但是由于时间可以自己掌握，不受限制，因此适用于高通量筛选。