RT-PCR技术操作流程

1.从细胞或特定组织中提取总RNA;

2.逆转录实验;

3.扩增内参和目的基因并比较基因表达差异。

适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。

适用于具有PolyA尾巴的RNA。(原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。)由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。

与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。

RT- PCR首先经反转录酶的作用以RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

RT-PCR反应受多个因素影响，如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度，扩增的循环数等。

◇建议选择0.5-3.0 mM (相差0.5 mM)的硫酸镁作初步实验。

◇对于具有较高Tm的引物，增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合，因而提高特异产物的得率。

◇大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太稀少，或者只有很少的起始材料，有必要增加扩增的次数到45-50次。

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粘贴钢板加固法，是指用胶黏剂将钢板粘贴在构件外部的一种加固方法。该法在建筑，桥梁等工程的加固、补强、修复中的应用较为广泛。

用粘结剂粘贴钢板补强、加固的钢筋混凝土结构构件，能大大提高其原设计承载力和抗破坏能力。这是因为粘贴钢板后，提高了原结构构件的配筋量，相应就提高了结构构件的抗拉、抗弯、抗剪等方面的力学性能，而这些性能是靠结构胶粘剂的良好粘结性能，把钢板与混凝土牢固地粘结在一起，形成整体，有效地传递应力，共同工作来保证的。

1、适用于承受静力作用的一般受弯及受拉构件。

2、使用环境温度不超过5~60℃，相对湿度不大于70%及无化学腐蚀的使用条件为限，否则应采取有效的防护措施。

3、当构件混凝上强度等级低于Cl5 时，不宜采用本法加固

粘贴面处理 → 加压固定及卸荷系统准备(根据实际情况和设计要求，卸荷步骤有时省去) →胶粘剂配制 →涂胶和粘贴 → 固化、卸加压固定系统 → 检验 → 维护