中文名 | [色谱]柱 | 外文名 | [chromatographic] column |
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所属学科 | 计量学 | 公布年度 | 2015年 |
《计量学名词》第一版
内装固定相用以分离混合组分的柱管。
毛细管色谱柱一般是用石英拉制而成,其外表面涂泽一层聚酰亚胺起保护作用,内部根据需要涂一层固定液
1、中低压色谱的压力区分 中压5~20bar,一般由泵提供压力;低压0~5 bar,可由压缩气体或泵提供压力;中压色谱可以使用更细的填料或更长的柱子,分辨率高于低压色谱; 2、中低压色谱柱 ...
色谱柱的维护与保养在高压液相色谱中的应用 (一 ) 摘要:科学技术的发展, 使得色谱技术也得到进一步的发展, 不断有新的联用的技术得到应 用。生物医学的发展, 也不断要求高灵敏和高选择性的方法对研究的对象进行定性和定量的 研究。 关键词:色谱柱维护与保养高压液相色谱应用 0 引言 色谱作为一种分离技术与方法, 自本世纪初起已经有 100 多年的历史了, 现在已经成为分析 化学学科中的一个重要的分支。 在人类进入新时代之际, 人们面临着在信息科学、 生命科学、 材料科学、 环境科学等领域的快速发展的挑战, 在这些领域人才的需求成为国家高度发展的 至关重要的因素。而色谱技术是生命科学、材料科学、环境科学必不可少的手段和工具。根 据最近的统计在全世界各类分析仪器中气象色谱仪和液相色谱仪的营销总额占 25%-30%。 科学技术的发展, 使得色谱技术也得到进一步的发展, 不断有新的联用的技术得到应
色谱柱是进行色谱分析的主要仪器,色谱柱的正确安装才能保证发挥其最佳的性能和延长使用寿命。 正确的安装请参考以下步骤:
步骤1. 检查气体过滤器、载气、进样垫和衬管等检查气体过滤器和进样垫,保证辅助气和检测器的用气畅通有效。如果以前做过较脏样品或活性较高的化合物,需要将进样口的衬管清洗或更换。
步骤2. 将螺母和密封垫装在色谱柱上,并将色谱柱两端要小心切平
步骤3. 将色谱柱连接于进样口上色谱柱在进样口中插入深度根据所使用的GC仪器不同而定。正确合适的插入能最大可能地保证试验结果的重现性。通常来说,色谱柱的入口应保持在进样口的中下部,当进样针穿过隔垫完全插入进样口后如果针尖与色谱柱入口相差1-2cm,这就是较为理想的状态。(具体的插入程度和方法参见所使用GC的随机手册)避免用力弯曲挤压毛细管柱,并小心不要让标记牌等有锋利边缘的物品与毛细柱接触摩擦,以防柱身断裂受损。将色谱柱正确插入进样口后,用手把连接螺母拧上,拧紧后(用手拧不动了)用扳手再多拧1/4-1/2圈,保证安装的密封程度。因为不紧密的安装,不仅会引起装置的泄漏,而且有可能对色谱柱造成永久损坏。
步骤4. 接通载气当色谱柱与进样口接好后,通载气, 调节柱前压以得到合适的载气流速(见下表)。
Psi |
15m |
25m |
30m |
50m |
100m |
0.20mm |
10-15 |
20-30 |
18-30 |
40-60 |
80-120 |
0.25mm |
8-12 |
13-22 |
15-25 |
28-45 |
55-90 |
0.32mm |
5-10 8- |
15 |
10-20 |
16-30 |
32-60 |
0.53mm |
1-2 |
2-3 |
2-4 |
4-8 |
6-14 |
以上仅为建议的起始设置,具体数值要依据实际的载气流速。将色谱柱的出口端插入装有己烷的样品瓶中,正常情况下,我们可以看见瓶中稳定持续的气泡。如果没有气泡,就要重新检查一下载气装置和流量控制器等是否正确设置,并检查一下整个气路有无泄漏。等所有问题解决后,将色谱柱出口从瓶中取出,保证柱端口无溶剂残留,再进行下一步的安装。
步骤5. 将色谱柱连接于检测器上其安装和所需注意的事项与色谱柱与进样口连接大致相同。如果在应用中系统所使用的是ECD或NPD等,那么在老化色谱柱时,应该将柱子与检测器断开,这样检测器可能会更快达到稳定。
步骤6. 确定载气流量,再对色谱柱的安装进行检查注意:如果不通入载气就对色谱柱进行加热,会快速且永久性的损坏色谱柱。
步骤7. 色谱柱的老化色谱柱安装和系统检漏工作完成后,就可以对色谱柱进行老化了。
对色谱柱升至一恒定温度,通常为其温度上限。特殊情况下,可加热至高于最高使用温度10-20℃左右,但是一定不能超过色谱柱的温度上限,那样极易损坏色谱柱。当到达老化温度后,记录并观察基线。初始阶段基线应持续上升,在到达老化温度后5-10分钟开始下降,并且会持续30-90分钟。当到达一个固定的值后就会稳定下来。如果在2-3小时后基线仍无法稳定或在15-20分钟后仍无明显的下降趋势,那么有可能系统装置有泄漏或者污染。遇到这样的情况,应立即将柱温降到 40℃以下,尽快的检查系统并解决相关的问题。如果还是继续的老化,不仅对色谱柱有损坏而且始终得不到正常稳定的基线。
一般来说,涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间长,而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。而PLOT色谱柱的老化方法有各不相同。 PLOT柱的老化步骤:HLZ Pora 系列 250℃, 8小时以上Molesieve分子筛 300℃ 12小时Alumina氧化铝 200℃ 8小时以上由于水在氧化铝和分子筛PLOT柱中的不可逆吸附,使得这两种色谱柱容易发生保留行为漂移。
当柱子分离过含有高水分样品后,需要将色谱柱重新老化,以除去固定相中吸附的水分。
步骤8. 设置确认载气流速对于 毛细管色谱柱,载气的种类首选高纯度氮气或氢气。载气的纯度最好大于99.995%,而其中的含氧量越少越好。如果您使用的是 毛细管色谱柱,那么依照载气的平均线速度(cm/sec),而不是利用载气流量(ml/min)来对载气做出评价。因为柱效的计算采用的是载气的平均线速度。推荐平均线速度值:氮气:10-12cm/sec 氢气:20-25cm/sec载气杂质过滤器在载气的管线中加入气体过滤装置不仅可以延长色谱柱寿命,而且很大程度的降低了背景噪音。建议最好安装一个高容量脱氧管和一个载气净化器。使用ECD系统时,最好能在其辅助气路中也安装一个脱氧管。
步骤9. 柱流失检测在色谱柱老化过程结束后,利用程序升温作一次空白试验(不进样)。一般是以10℃/min从50℃升至最高使用温度,达到最高使用温度后保持 10min。这样我们就会的到一张流失图。这些数值可能对今后作对比试验和实验问题的解决有帮助。空白试验的色谱图,不应该有色谱峰出现。如果出现了色谱峰,通常可能是从进样口带来的污染物。如果在正常的使用状态下,色谱柱的性能开始下降,基线的信号值会增高。另外,如果在很低的温度下,基线信号值明显的大于初始值,那么有可能是色谱柱和 GC系统有污染。其他:色谱柱的保存用进样垫将色谱柱的两端封住,并放回原包装。在安装时要将色谱柱的两端截去一部分,保证没有进样垫的碎屑残留于柱中。
注意:当空气中氢气的含量在4-10%时,就有爆炸的危险。所以一定要保证实验室有良好的通风系统。 2100433B
chromatographic column
装填有固定相用以分离混合组分的柱管。
多为金属或玻璃制作。有直管形、盘管形、U形管等形状。
色谱柱可分为填充柱和开管柱两大类。液相色谱通常均采用填充柱。
色谱柱的分离效果取决于所选择的固定相,以及色谱柱的制备和操作条件。
色谱是一种分离分析手段,分离是核心,因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好,分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等,其粒度一般为3,5,7,10μm等,柱效理论值可达5~16万/米。对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于同系物分析,只要500即可;对于较难分离物质对则可采用高达2万的柱子,因此一般10~30cm左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
柱效受柱内外因素影响,为使色谱柱达到最佳效率,除柱外死体积要小外,还要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。即使最好的装填技术,在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的,靠近管壁的部位比较疏松,易产生沟流,流速较快,影响冲洗剂的流形,使谱带加宽,这就是管壁效应。这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍粒径的厚度。在一般的液相色谱系统中,柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
柱色谱是在一根玻璃管或金属管中迸行的色谱技术,将吸附剂填充到管中而使之成为柱状,这样的管状柱称为吸附色谱柱。使用吸附色谱柱分离混合物的方法,称为吸附柱色谱。这种方法可以用来分离大多数有机化合物,尤其适合于复杂的天然产物的分离。分离容量从几毫克到百毫克级,所以,适用于分离和精制较大量的样品。
在吸附柱色谱中,吸附剂是固定相,洗脱剂是流动相,相当于薄层色谱中的展开剂。吸附剂的基本原理与吸附薄层色谱相同,也是基于各组分与吸附剂间存在的吸附强弱差异,通过使之在柱色谱上反复进行吸附、解吸、再吸附、再解吸的过程而完成的。所不同的是,在进行柱色谱的过程中,混合样品一般是加在色谱柱的顶端,流动相从色谱柱顶端流经色谱柱,并不断地从柱中流出。由于混合样中的各组分与吸附剂的吸附作用强弱不同,因此各组分随流动相在柱中的移动速度也不同,最终导致各组分按顺序从色谱柱中流出。如果分步接收流出的洗脱液,便可达到混合物分离的目的。一般与吸附剂作用较弱的成分先流出,与吸附作用较强的成分后流出。
根据待分离组分的结构和性质选择合适的吸附剂和洗脱剂是分离成败的关键。
1. 吸附剂的要求
一种合适的吸附剂,一般应满足下列几个基本要求:
⑴对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应,在洗脱剂中也不会溶解。
⑵对待分离组分能够进行可逆的吸附,同时具有足够的吸附力,使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。
⑶颗粒形状均匀,大小适当,以保证洗脱剂能够以一定的流速 (一般为1.5 mL·min-1)通过色谱柱。
⑷材料易得,价格便宜而且是无色的,以便于观察。可用于吸附剂的物质有氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙 (镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。其中有些对几类物质分离效果较好,而对其它大多数化合物不适用。
2. 几种常见吸附剂
⑴氧化铝: 市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型,粒度规格大多为100~150目。
碱性氧化铝 (pH 9-10)适用于碱性物质 (如胺、生物碱)和对酸敏感的样品(如缩醛、糖苷等),也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以,这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。
酸性氧化铝 (pH 3.5-4.5)适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等的分离。
中性氧化铝 (pH 7-7.5)适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离,也可以用来分离弱的有机酸和碱等。
⑵硅胶: 硅胶是硅酸的部分脱水后的产物,其成分是SiO2·xH2O,又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。
⑶聚酰胺: 聚酰胺是聚己内酰胺的简称,商业上叫做锦纶、尼龙-6或卡普纶。色谱用聚酰胺是一种白色多孔性非晶形粉末,它是用锦纶丝溶于浓盐酸中制成的(制法详见附录十)。不溶于水和一般有机溶剂,易溶于浓无机酸、酚、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中。聚酰胺分子表面的酰氨基和末端胺基可以和酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成强度不等的氢键,因此可以分离上述化合物,也可以分离含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。
⑷硅酸镁: 中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间,主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。为了得到中性硅酸镁,用前先用稀盐酸,然后用醋酸洗涤,最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。
3. 吸附剂的活度及其调节
吸附剂的吸附能力常称为活度或活性。吸附剂的活性取决于它们含水量的多少,活性最强的吸附剂含有最少的水。吸附剂的活性一般分为五级,分别用I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和V表示。数字越大,表示活性越小,一般常用Ⅱ和Ⅲ。向吸附剂中添加一定的水,可以降低其活性;反之,如果用加热处理的方法除去吸附剂中的部分水,则可以增加其活性,后者称为吸附剂的活化。
4.吸附剂和洗脱剂的选择
样品在色谱柱中的移动速度和分离效果取决于吸附剂对样品各组分的吸附能力大小和洗脱剂对各组分的解吸能力大小,因此,吸附剂的选择和洗脱剂的选择常常是结合起来进行的。首先,根据待分离物质的分子结构和性质,结合各种吸附剂的特性,初步选择一种吸附剂。然后根据吸附剂和待分离物质之间的吸附力大小,选择出认为适宜的洗脱剂。最后,采用薄层色谱法进行试验。根据试验结果,再进一步决定是调节吸附剂的活性,还是更换吸附剂的种类,或是改变洗脱剂的极性。直到确定出合适的吸附剂和洗脱剂为止。
物质与吸附剂之间的吸附能力大小既与吸附剂的活性有关,又与物质的分子极性有关。分子极性越强,吸附能力越大,分子中所含极性基团越多,极性基团越大,其吸附能力也就越强。具有下列极性基团的化合物,其吸附能力按下列次序递增:
-Cl,-Br,-I<-C=C-<-OCH3<-CO2R<-CO-<-CHO<-SH<-NH2<-OH<-COOH
1. 装柱
色谱柱的大小规格由待分离样品的量和吸附难易程度来决定。一般柱管的直径为0.5~l0 cm,长度为直径的10~40倍。填充吸附剂的量约为样品重量的20~50倍,柱体高度应占柱管高度的3/4,柱子过于细长或过于粗短都不好。装柱前,柱子应干净、干燥,并垂直固定在铁架台上,将少量洗脱剂注入柱内,取一小团玻璃毛或脱脂棉用溶剂润湿后塞入管中,用一长玻璃棒轻轻送到底部,适当捣压,赶出棉团中的气泡,但不能压得太紧,以免阻碍溶剂畅流 (如管子带有筛板,则可省略该步操作)。再在上面加入一层约0.5 cm厚的洁净细砂,从对称方向轻轻叩击柱管,使砂面平整。
常用的装柱方法有干装法和湿装法两种。
⑴干装法:在柱内装入2/3溶剂,在管口上放一漏斗,打开活塞,让溶剂慢慢地滴入锥形瓶中,接着把干吸附剂经漏斗以细流状倾泻到管柱内,同时用套在玻璃棒 (或铅笔等)上的橡皮塞轻轻敲击管柱,使吸附剂均匀地向下沉降到底部。填充完毕后,用滴管吸取少量溶剂把粘附在管壁上的吸附剂颗粒冲入柱内,继续敲击管子直到柱体不再下沉为止。柱面上再加盖一薄层洁净细砂,把柱面上液层高度降至0.1~l cm,再把收集的溶剂反复循环通过柱体几次,便可得到沉降得较紧密的柱体。
⑵湿装法:基该方法与干装法类似,所不同的是,装柱前吸附剂需要预先用溶剂调成淤浆状,在倒入淤浆时,应尽可能连续均匀地一次完成。如果柱子较大,应事先将吸附剂泡在一定量的溶剂中,并充分搅拌后过夜 (排除气泡),然后再装。无论是干装法,还是湿装法,装好的色谱柱应是充填均匀,松紧适宜一致,没有气泡和裂缝,否则会造成洗脱剂流动不规则而形成"沟流",引起色谱带变形,影响分离效果。
2. 加样
将干燥待分离固体样品称重后,溶解于极性尽可能小的溶剂中使之成为浓溶液。将柱内液面降到与柱面相齐时,关闭柱子。用滴管小心沿色谱柱管壁均匀地加到柱顶上。加完后,用少量溶剂把容器和滴管冲洗净并全部加到柱内,再用溶剂把粘附在管壁上的样品溶液淋洗下去。慢慢打开活塞,调整液面和柱面相平为止,关好活塞。如果样品是液体,可直接加样。
3. 洗脱与检测
将选好的洗脱剂沿柱管内壁缓慢地加入柱内,直到充满为止 (任何时候都不要冲起柱面覆盖物)。打开活塞,让洗脱剂慢慢流经柱体,洗脱开始。在洗脱过程中,注意随时添加洗脱剂,以保持液面的高度恒定,特别应注意不可使柱面暴露于空气中。在进行大柱洗脱时,可在柱顶上架一个装有洗脱剂的带盖塞的分液漏斗或倒置的长颈烧瓶,让漏斗颈口浸入柱内液面下,这样便可以自动加液。如果采用梯度溶剂分段洗脱,则应从极性最小的洗脱剂开始,依次增加极性,并记录每种溶剂的体积和柱子内滞留的溶剂体积,直到最后一个成分流出为止。洗脱的速度也是影响柱色谱分离效果的一个重要因素。大柱一般调节在每小时流出的毫升数等于柱内吸附剂的克数。中小型柱一般以1~5滴/秒的速度为宜。
洗脱液的收集,有色物质,按色带分段收集,两色带之间要另收集,可能两组分有重叠。对无色物质的接收,一般采用分等份连续收集,每份流出液的体积毫升数等于吸附剂的克数。若洗脱剂的极性较强,或者各成分结构很相似时,每份收集量就要少一些,具体数额的确定,要通过薄层色谱检测,视分离情况而定。现在,多数用分步接受器自动控制接收。
洗脱完毕,采用薄层色谱法对各收集液进行鉴定,把含相同组分的收集液合并,除去溶剂,便得到各组分的较纯样品。